ウガンダ北部におけるジヒドロアルテミシニンとルメファントリンの両方に対する熱帯熱マラリア原虫の感受性の低下

Nature Communications volume 13、記事番号: 6353 (2022) この記事を引用

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アルテミシニン部分耐性は、併用療法パートナー薬剤に対して耐性のある熱帯熱マラリア原虫の選択を容易にする可能性がある。私たちは、耐性に関連する PfK13 C469Y および A675V 変異が出現したウガンダ北部と、これらの変異がまれであるウガンダ東部から 2021 年に収集された熱帯熱マラリア原虫分離株 99 株を評価しました。 ex vivo リング生存アッセイでは、469Y 変異 (生存中央値は変異型 7.3%、混合型 2.5%、野生型 1.4%) および/またはプフコロニンまたはファルシパイン 2a の変異を持つ分離株の生存率が有意に高かった。生存率が 5% を超えるすべての分離株は、これらのタンパク質の少なくとも 1 つに変異を持っていました。 ex vivo 増殖阻害アッセイでは、ルメファントリン (IC50 中央値 14.6 対 6.9 nM、p < 0.0001) およびジヒドロアルテミシニン (2.3 対 1.5 nM、p = 0.003) に対する感受性はウガンダ北部と東部で減少しました。北部分離株のうち 14/49 対東部分離株 0/38 は、ルメファントリン IC50 > 20 nM でした (p = 0.0002)。 2015年から2021年に分離された819株の標的配列決定により、薬物感受性の変化、特にルメファントリンに対する感受性の低下を伴うPfK13 469Y（p = 6 × 10−8）およびクロロキン耐性を伴うPfCRT変異（p = 1 × 10−20）に関連する複数の多型が同定された。。私たちの結果は、ウガンダにおける第一選択の抗マラリア薬であるアルテメテル・ルメファントリンの活性に関する懸念を引き起こしています。

薬剤耐性は数十年にわたり、熱帯熱マラリアの治療と制御に課題をもたらしてきました1。現在マラリアの治療に使用されている最も重要な薬剤であるアルテミシニンに対する部分的な耐性は、約 15 年前に東南アジアで確認されました 2,3。部分耐性表現型は、アルテミシニンによる患者の治療後の寄生虫の排除の遅延4、またはジヒドロアルテミシニン (DHA) への曝露後の培養寄生虫の生存の増強を伴います5。東南アジアにおける部分耐性は、熱帯熱マラリア原虫ケルチ 13 (PfK13) タンパク質のプロペラドメインにおける約 20 の候補変異または検証された変異のいずれかと関連していることが示されています 6,7。アルテミシニン耐性の東南アジア寄生虫における PfK13 変異にはさらなる多型が伴い 8,9、DHA によるアフリカ寄生虫の in vitro 選択により、熱帯熱マラリア原虫コロニン (Pfcoronin) の変異に関連するクリアランスの遅延が引き起こされました 10。東南アジアで耐性メディエーターとして検証された PfK13 変異は、世界の他の地域でも報告されています 11,12,13 が、最近まで、これらの変異の持続的な蔓延や臨床耐性または in vitro 耐性の文書化の証拠は不足していました 14。最大の懸念は、マラリアの罹患率と死亡率の大部分が見られるアフリカでの耐性の出現または拡大の可能性である15。最近、これまでアジアにおけるアルテミシニン部分耐性に関連していた PfK13 変異が東アフリカで報告され、ルワンダでは PfK13 R561H 変異が出現し 16,17,18、ウガンダ北部では C469Y および A675V 変異が出現しました 19,20,21,22。限られた研究では、C469Y、R561H、および A675V 変異は、臨床的に測定されたアルテミシニン部分耐性（クリアランスの遅延）またはインビトロ（生存期間の向上）と関連していることが示されています 17,22 が、最近出現した熱帯熱マラリア原虫の影響についての我々の理解はまだ明らかになっていません。アフリカにおける薬物感受性と主要なアルテミシニンベースの併用療法（ACT）の治療効果に関する変異の解明は不完全である。

ACT は、速効性のアルテミシニンと遅効性のパートナー薬剤を組み合わせたものです23。東南アジアでは、アルテミシニンの部分耐性の出現に続いて、ACT パートナー薬であるメフロキン 24 およびピペラキン 25 の抗マラリア活性の低下の証拠が示されました。特に、主に PfK13 580Y 変異に関連するアルテミシニン、および PfCRT およびプラスメプシン 2/3 遺伝子増幅の新規変異に関連するピペラキンに対する耐性により、カンボジアでは DHA ピペラキンの失敗率が 50% を超えました 26,27,28。最近東アフリカでアルテミシニンに対する部分耐性が出現したことも同様に、ACT パートナー薬剤に対する感受性が低下した寄生虫の選択につながる可能性があります。アフリカにおけるマラリアの膨大な犠牲者を考慮すると、1980年代のクロロキン耐性の出現で見られたように、この結果は壊滅的なものとなる可能性があり、数百万人の過剰なマラリア死亡をもたらします29。

アフリカでマラリアの治療に最も一般的に使用されている ACT はアルテメーテルルメファントリンです。ほとんどの抗マラリア薬とは異なり、ルメファントリンは単独療法としては利用できず、アルテメテルと組み合わせてのみ供給されます。おそらくこの理由から、ルメファントリンに対する熱帯熱マラリア原虫耐性は、野外で分離された寄生虫では明確には確認されていません。しかし、不安定なルメファントリン耐性表現型は、in vitro での薬物との長期インキュベーションによって選択され 30、野外分離株の研究ではルメファントリンに対する感受性の変動が見られています。ルメファントリン感受性は、薬物輸送体と推定される PfMDR1 の多型と関連しています。 PfMDR1 86Y 変異は、アモジアキンの使用によって選択され、アルテメーテルルメファントリンによる治療によって選択され、ウガンダ 20 を含むアフリカのほとんどの地域 15 では近年、有病率が非常に低く減少しました。野生型 PfMDR1 N86 遺伝子型は、86Y 変異体原虫と比較して ex vivo ルメファントリン感受性が低いことと関連しており 31,32、31 件の臨床試験データの分析では治療失敗と関連していました 33 が、この対立遺伝子に関連する感受性の変化はわずかでした。ルメファントリン感受性も pfmdr1 遺伝子増幅によって低下します 34,35 が、この多型は研究されたアフリカの寄生虫では非常にまれです 15。ウガンダでは、PfMDR1 86Y 変異の喪失に伴いルメファントリン感受性が時間の経過とともに若干減少し 31,32,36,37、アルテスネート-アモジアキンと比較したアルテメテル-ルメファントリンの相対的な臨床有効性は時間の経過とともに減少し、最近の試験では補正されたことが示されました。アルテメテル・ルメファントリンの治療効果は、1 つの部位で 90% 未満でした 39。全体として、ルメファントリンのインビトロ活性とアルテメーテルルメファントリンの臨床効果は概して良好なままですが、活性が低下している可能性があるという証拠があります。

最近、ウガンダ北部でアルテミシニン耐性熱帯熱マラリア原虫が出現したことにより、東南アジアで見られるように、ACT パートナー薬剤に対する耐性も発生するのではないかという懸念が生じています。この可能性を探り、ウガンダにおけるアルテミシニン部分耐性をよりよく特徴づけるために、近年PfK13 469Yおよび675V変異が出現したウガンダ北部と、臨床分離株を長年研究してきたウガンダ東部で採取した寄生虫の遺伝子型と表現型を比較した。 10 年間、アルテミシニン耐性のマーカーは珍しいものでした。さらに、薬剤感受性表現型の遺伝的相関関係をより詳しく調査するために、ウガンダ東部からの表現型が特定された分離株の大規模なバンクを分析しました。

国内のさまざまな地域からの分離株を比較するために、ウガンダ北部のアゴゴ地区にあるパトンゴ保健センター III (n = 57) とトロロで、単純性熱帯熱マラリアを呈する患者から収集した分離株の遺伝子型、成長阻害、およびリング生存率を評価しました。トロロ地区の郡病院とムバレ地区のブシウ保健センター IV、ウガンダ東部の近隣の 2 か所（n = 42）、2021 年 5 月 31 日から 8 月 16 日まで（図 1）。これらのサンプルを提供した参加者の特徴と彼らの感染の特徴を表1に示します。より広範な調査で、上記の施設とブシアのマサフ病院を含む、単純性熱帯熱マラリアを呈する819人の患者から分離された株の遺伝子型と増殖阻害を評価しました。地区、2015 年 12 月 9 日から 2021 年 8 月 20 日まで (表 1)。 2019 年までのウガンダ東部のサンプルの薬物感受性は以前に発表されました 32。このレポートでは、潜在的な耐性メディエーターの詳細な配列決定と薬剤感受性の表現型の間の関連に焦点を当てています。

研究サイトにはラベルが付けられています。 2019 年からの監視データが入手可能な地区における PfK13 469Y 変異と 675V 変異の合計有病率がカラースケールで表示されます21。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

2021年にウガンダ北部と東部で同時に収集された分離株について、分子反転プローブ（MIP）アッセイを使用して、薬剤耐性を媒介する可能性のある80個の遺伝子の配列を特徴付けました（補足表1）。特に興味深いのは、ACT の成分に対する感受性の変化に最近関連した寄生虫多型、すなわちアルテミシニンに対する部分耐性に関連する PfK13 プロペラドメイン変異、およびルメファントリン (pfmdr1 増幅および変異) およびピペラキン (プラスメプシン 2/3 増幅) に対する感受性の変化に関連する多型でした。および新規の PfCRT 変異）。最近のデータと一致して、PfK13 C469Y および A675V 変異の有病率はウガンダ東部に比べて北部で高かった (C469Y 34% vs. 3%、p < 0.001; A675V 13% vs. 3%、p = 0.06、表 2)。。他の PfK13 プロペラドメイン変異は一般的ではありませんでした。プロペラドメインの上流で 15 の変異が同定されました。アジアでは、pfmdr1 またはプラスメプシン 2/3 遺伝子の増幅も、ピペラキン耐性に関連する PfCRT 変異も見られませんでした (T93S、H97Y、F145I、I218F、M343L、G353V)40,41。これまでに薬剤耐性に関連する他の十分に報告されている多型を考慮すると、アミノキノリンに対する感受性の変化に関連するトランスポーター PfCRT (K76T) および PfMDR1 (N86Y、D1246Y) における変異の有病率は非常に低く、PfDHFR における 5 つの変異 (N51I、D1246Y) の有病率は非常に低かった。葉酸拮抗薬ピリメタミンおよびスルファドキシンに対する耐性に関連するC59R、S108N)およびPfDHPS(A437G、K540E)の変異は非常に高く、高レベルの葉酸拮抗薬耐性に関連するPfDHFR(I164L)およびPfDHPS(A581G)のさらなる変異が低い有病率で見られました。ウガンダの最近のデータと一致しています (表 2)20,21。

ウガンダ北部および東部の寄生虫におけるルメファントリン (A 増殖阻害アッセイ) および DHA (B RSA) に対する感受性。各点は、単一の分離株の結果を表します (ウガンダ北部では A n = 49、ウガンダ東部では 38、ウガンダ北部では B n = 52、ウガンダ東部では 29)。 P 値は、両側マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定を使用して決定されました。ボックスの中心の境界は中央値に対応し、最小境界と最大境界はそれぞれ 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルに対応します。ひげは、25 パーセンタイルまたは 75 パーセンタイルから IQR の 1.5 倍を超えない極端な値まで伸びます。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

リング生存アッセイ (RSA) で研究された 2021 年からの分離株の場合、サンプルは 4 °C で保存され、収集日にトロロの研究室に輸送されました。培養開始前の保管時間は、ウガンダ北部とウガンダ東部で収集されたサンプルの方がわずかに長かった（中央値は北部で25.0時間、ウガンダ東部では24.0時間、p = 0.001）。 7 種類の抗マラリア薬のパネルに対する感受性を標準的な増殖阻害 (IC50) アッセイで研究し、DHA については ex vivo RSA で研究しました。国内の 2 つの地域で収集された寄生虫の検査が並行して実行されました。クロロキン、デスエチルアモジアキン (アモジアキンの活性代謝物)、ピペラキン、メフロキン、およびピロナリジンに対する感受性は 2 つの部位間で同様であり、これらの各薬剤の IC50 は一般に感受性が高いと考えられるレベルでした (表 3)。対照的に、ルメファントリンと DHA については、ウガンダ北部の分離株はウガンダ東部の分離株よりも感受性が有意に低かった（ボンフェローニ補正後）（ルメファントリン IC50 14.6 対 6.9 nM、p < 0.0001; ジヒドロアルテミシニン IC50 2.3 対 1.5 nM、p = 0.003） ; 表3)。ルメファントリンについては、北部からの分離株 49 株のうち 14 株が、IC50 が 20 nM を超えるものはありませんでしたが、ウガンダ東部からの分離株 38 株はいずれもありませんでした (p = 0.0002、図 2)。 6時間のDHAパルス開始から72時間後に寄生虫を計数するRSAでは、北部（52サンプルで生存中央値2.5％）と東部（29サンプルで生存中央値1.4％）の分離株の間で生存率に有意な差は示されなかった。 0.53) ウガンダではありましたが、注目すべきことに、寄生虫除去の遅れに関連する PfK13 変異を持ついくつかの寄生虫が両方の場所に存在していました (図 2)。

利用可能な RSA データを含む 2021 年の 81 サンプルで、リングの生存と PfK13 遺伝子型の間の関連性を検索しました。 PfK13 469Y 変異を持つ分離株は生存率が著しく高く、混合寄生虫 (2.5%) および純粋野生型寄生虫 (1.4%) と比較して、純粋変異型 (中央値 7.3%) の生存率が最も高かった (図 3)。 PfK13 675 V 変異は生存率の増加と関連していませんでしたが、この分析はサンプルサイズによって制限され、研究に利用できる純粋な変異 675 V 分離株は 2 つだけでした。潜在的な耐性決定因子をより広範に検討するために、マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定を使用して、変異体がアルテミシニン部分耐性に関連している23個の遺伝子の多型とRSAの結果との関連を検索しました（補足表1）。「方法」で説明されているように、まれな多型は集合変数として評価されました。 5 つの遺伝子の多型は、野生型と比較してリング生存の減少または増加と関連していました (補足表 2)。これらの遺伝子のうち、より一般的な対立遺伝子 (メジャー対立遺伝子) を野生型、マイナー対立遺伝子を変異体と考えると、プフコロニンの 8 つの変異のいずれか (変異体での生存率 6.5% 対野生型での生存率 2.3%、p = 0.04)、または次のいずれかが考えられます。ファルシパイン 2a の 17 個の変異 (変異体での生存率 3.2%、野生型での生存率 0.6%、p = 0.02) は、単独または PfK13 変異との関連で、リング生存率の増加と最も強く関連していました (図 4)。複合的な影響を考慮すると、PfK13 469Y とプフコロニンの変異の存在 (生存中央値は二重変異体で 12.6% 対、二重野生型では 1.4%、p = 0.009)、またはファルシパイン-2a (生存中央値は二重変異体で 3.9% 対 0.0) % (二重野生型、p = 0.004) も生存率の増加と関連していました。注目すべきことに、野生型 PfK13 配列を持つ一部の分離株は高レベルのリング生存率を示しましたが、これらの外れ値はファルシパイン 2a の変異によって説明されるようです。リング生存率 >5% のすべての分離株は、PfK13 469Y 変異、ファルシパイン-2a 変異、またはその両方を持っていました。興味深いことに、プロペラドメイン外の PfK13 の変異は RSA 生存率の低下と関連していました (PfK13 469Y の効果の逆)。同定された15の非プロペラ変異のいずれかを考慮すると、生存率は42の変異体で1.5％、26の完全野生型分離株では5.5％であった（p = 0.02;補足表2）。重要な独立した関連性を持つ他の 2 つの多型は、RSA 生存率の増加と関連する推定上のユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素 1 の欠失と、生存率の減少と関連する機能不明のタンパク質をコードする遺伝子の SNP でした。

各点は単一分離株の結果を表します (A n = 50 WT、18 C469Y、6 A675V; B n = 50 WT、8 C469Y、10 469Y、4 A675V、2 675V)。結果は、混合分離株と純粋変異分離株を組み合わせたもの (A) または個別に示したもの (B) として示されています。 P 値は、両側マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定を使用して決定されました。ボックスの中心の境界は中央値に対応し、最小境界と最大境界はそれぞれ 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルに対応します。ひげは、25 パーセンタイルまたは 75 パーセンタイルから IQR の 1.5 倍を超えない極端な値まで伸びます。 WT、野生型。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

異なる PfK13、フコロニン (CRN; A、B)、およびファルシパイン-2a (FP2a; C、D) 遺伝子型を持つ寄生虫における RSA による DHA に対する感受性を示します。各点は単一分離株の結果を表します（A n = 38 WT、18 Mut、B n = 26 C469 + CRN-WT、9 C469 + CRN-Mut、12 469Y + CRN-WT、5 469Y + CRN-Mut; C n = 17 WT、47 Mut、D n = 11 C469 + FP2a-WT、30 C469 + FP2a-Mut、3 469Y + FP2a -WT、15 469Y + FP2a-Mut）。コドン 469 の PfK13 遺伝子型が示されています。変異体 469Y には混合分離株が含まれます。 P 値は、両側マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定を使用して決定されました。ボックスの中心境界は中央値に対応し、最小境界と最大境界はそれぞれ 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルに対応します。ひげは、25 パーセンタイルまたは 75 パーセンタイルから IQR の 1.5 倍を超えない極端な値まで伸びます。 WT、野生型、Mut、任意のプフコロニンまたはファルシパイン 2a 多型。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

2021年にウガンダ北部と東部から採取されたサンプルの結果を比較すると、PfK13 469Yまたは675V変異を有する分離株は、ルメファントリンに対する感受性が著しく低かった（IC50は、混合または変異体469Yでは14.1nM、混合または変異体675Vでは14.7nM、および8.7nM）野生型の場合;図5)。活性低下の決定要因の一部をルメファントリン 15 と共有すると思われるメフロキンなど、試験した他の薬剤に対する感受性は、野生型寄生虫と PfK13 変異体寄生虫の間で差がなかった。

各点は、単一の分離株の結果を表します (A n = 61 WT、17 C469Y、6 A675V; B n = 61 WT、7 C469Y、10 469Y、5 A675V、1 675V)。結果は、混合分離株と純粋変異分離株を組み合わせたもの (A) または個別に示したもの (B) として示されています。 P 値は、両側マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定を使用して決定されました。ボックスの中心境界は中央値に対応し、最小境界と最大境界はそれぞれ 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルに対応します。ひげは、25 パーセンタイルまたは 75 パーセンタイルから IQR の 1.5 倍を超えない極端な値まで伸びます。 WT、野生型。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

表現型と遺伝子型の関連性をより広範に検討するために、増殖阻害データを持つ 819 株の大きなセットを利用しました。これらの分離株は主に 2015 年から 2021 年にかけてウガンダ東部から収集され、上記のように 2021 年にウガンダ北部で収集された 49 サンプルも含まれています。寄生虫 DNA は、薬剤感受性と潜在的に関連するタンパク質をコードする 80 個の遺伝子を対象とした MIP プラットフォームを使用して遺伝子型特定されました。これには、薬剤輸送体であることが知られているか予測されているタンパク質、および確立された抗マラリア薬や開発中の化合物に対する耐性に多型が既知または関与していると疑われるタンパク質が含まれます。表1）。我々は合計 4,337 個の多型を同定し、マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定を使用して ex vivo IC50 の変動とこれらの多型の存在との関係を調査しました。

上述したように、ウガンダ北部と東部のサンプルで感受性の大きな違いが確認されたため、我々は最初にルメファントリンに焦点を当てました。 713 の分離株の評価において、p ≤ 0.01 の有意性で、ルメファントリン IC50 に関連する 33 の非同義多型を同定しました。次に、混合対立遺伝子と変異対立遺伝子の IC50 中央値が同じ方向に傾向があり (どちらも純粋な野生型遺伝子型を持つ寄生虫と比較して薬剤感受性が増加または減少していた)、純粋な少数対立遺伝子が少なくとも 1 つに存在する遺伝子座のみを含めるようにフィルター処理しました。サンプル。これにより、ルメファントリンに対する感受性の変化に関連する9つの遺伝子における多型が同定された(表4)。最も注目すべきは、ウガンダ北部で出現した PfK13 変異は、ルメファントリンに対する感受性の低下と強く関連していたことです (469Y、p = 6 × 10−8; 675 V p = 0.001)。ルメファントリンに対する感受性の増加または低下とのその他の関連には、現在では非常にまれであるが、以前はルメファントリン感受性の増加と関連していた 86Y 変異を含む、PfMDR1 の SNP が含まれていました。および推定ホスホリパーゼの多型。 ApiAP2転写因子。多剤耐性タンパク質 PfMRP1 および PfMRP2。ヘモグロビナーゼファルシパイン-2a、ファルシパイン-3、およびプラスメプシン I (表 4)。

ルメファントリンと同じフィルタリング基準を適用して、試験された他の 6 つの薬物を考慮すると、さまざまな多型と薬物感受性の間の関連性が、ほとんどが比較的低いレベルの有意性で特定されました (補足表 3～8)。最も印象的なのは、クロロキン耐性を媒介することが知られている K76T 変異を含む、PfCRT の十分に特徴付けられた変異と、クロロキンに対する感受性 (6 つの PfCRT 変異について p = 10−7−10−20) および関連薬剤モノデセチルアモジアキン (p = 4 つの PfCRT 変異の場合は 0.01 ～ 0.0003)。これらの結果は予想されたものであり 15、我々の分析の全体的な妥当性を裏付けています。

逸話的には、いくつかの注目すべき生体外薬剤感受性表現型は不安定であることが証明されており、培養適応後の抗マラリア薬のIC50はサンプル採取直後に見られる値と比較して低く、これは混合培養において薬剤耐性株と比較して薬剤感受性株の増殖がより成功していることで説明される可能性がある。。観察された表現型の安定性を調査するために、我々は、顕著なルメファントリン IC50 結果を持つ適応したウガンダ北部株を培養しました。ルメファントリン感受性は、初期の ex vivo 値と比較して、培養に適応した寄生虫の方が一般に高かった。元の ex vivo ルメファントリン IC50 値が 30 nM (IC50 中央値 39.5 nM) を超える 8 つの分離株について、4 週間以上培養した後、凍結、解凍、培養内での増殖、アッセイを繰り返した後に測定したその後の IC50 値は、一般に以下の値でした。 ex vivo の初期値 (表 5)。しかし、培養適応後、これら 8 つのウガンダ北部分離株の凍結融解再培養前 (IC50 中央値 13.2 nM) または凍結融解再培養後 (IC50 中央値 16.9 nM、米国で評価 7.4 nM) を測定した IC50 値は、収集された寄生虫の値を上回っていました。ウガンダ北部の分離株（分離株 38 株の IC50 中央値 6.9 nM）と直接比較するため、または以前に発表された分離株のより大きなセット（分離株 365 株の IC50 中央値 5.1 nM 32）を目的としてウガンダ東部から採取した。

PfK13 C469Y または A675V 変異を保有する熱帯熱マラリア原虫がウガンダ北部で出現したことにより、アルテミシニンと ACT パートナー薬剤の両方に耐性を持つ寄生虫の選択に関する懸念が生じ、第一選択の ACT がマラリアを効果的に治療できなくなる可能性があります。現状をより深く理解するために、近年PfK13変異が一般的となっているウガンダ北部と、まれであるウガンダ東部のマラリア患者から2021年に採取された分離株の薬剤感受性を直接比較した。我々は予想通り、ウガンダ北部の分離株でC469YおよびA675V変異の高い有病率を発見したが、その有病率はウガンダ東部の分離株で以前に見られたよりも高かった21。アルテミシニンに対する in vitro 感受性の標準的な尺度である DHA RSA を使用したところ、C469Y 変異と寄生虫生存率の低下との関連性は見られましたが、A675V 変異（研究に使用できるサンプルがほとんどなかった）とは関連性は見られませんでした。標準的な増殖阻害アッセイを使用したところ、ルメファントリンとDHAに対する感受性は、ウガンダ東部に比べて北部からの分離菌では有意に低かったが、他の試験薬剤に対する感受性は低かった。 2015年から2021年にかけて収集された、増殖阻害アッセイのみが利用可能なはるかに多数の分離株を考慮すると、ルメファントリンに対する感受性の低下はPfK13 469Y変異と強く関連していた。これらの結果は、アルテミシニンに対する部分的な耐性の出現がルメファントリンの活性低下を伴うことを示唆しており、ウガンダとアフリカのほとんどの地域における第一選択の抗マラリア薬であるアルテメーテル・ルメファントリンの有効性の喪失を予見する可能性がある。

ウガンダ北部で最近特定された PfK13 変異 19,20,21,22 が、アルテミシニン曝露後の寄生虫の生存増加と関連しているかどうかを判断することが重要です。以前の研究では、東南アジアにおける 675V 変異とアルテミシニンによる治療後の臨床的遅延クリアランスとの関連性が特定されました 7。ウガンダ北部で行われた最近の研究では、両方の変異が臨床的なクリアランス遅延と関連しており、生体外での 675V 変異のみが DHA 曝露後の生存期間を延長しましたが、研究では比較的少数の変異株分離株によって分析が制限されました 22。ルワンダでの研究では、2019年に採取された469 F、561H、および675 V変異を持つ単一分離株は、野生型寄生虫と比較してin vitroで生存率が増加したことが示された18が、我々の知る限り、469Y変異はこれまで生存率の増加と関連していなかった。 RSA。私たちの研究では、469Y 変異は RSA による生存率の向上と有意に関連していました。したがって、我々の結果は、ウガンダ北部で最近出現した両方の PfK13 変異がアルテミシニンの部分耐性に関連しているという結論を確固たるものとします。

多くの熱帯熱マラリア原虫タンパク質の多型は、PfK13 変異と関連して、または単独でアルテミシニンの部分耐性と関連していることが示されています8,10が、PfK13 以外の一貫したメディエーターは同定されておらず、耐性の媒介は高度に関与しているようです。寄生虫の遺伝的背景に依存します42。 23の候補遺伝子の多型とRSAの生存増強との関連性を評価した結果、生存増強と中程度の関連を示す多数の多型(補足表2)、およびファルシパイン-2aおよびフコロニンをコードする2つの遺伝子の多型との最も強い関連が特定された。

驚くべきことに、PfK13 469Y 変異がないにもかかわらず、RSA 生存率が 5% を超えるすべての分離株はファルシパイン 2a に変異を持っていました。ファルシパイン-2a で同定された 17 個の変異のうち、11 個は東南アジアの分離株でも同定されており、ファルシパイン-2a ハプロタイプは RSA 生存率の向上と関連していました9。ファルシパイン-2a は、ヘモグロビンを加水分解して寄生虫の代謝にアミノ酸を供給する際に、他のプロテアーゼと連携して重要な役割を果たすヘモグロビナーゼです 43。特定の阻害剤または遺伝子ノックアウトによる治療によりファルシパイン活性が失われると、DHA の抗マラリア活性が著しく鈍化し、アルテミシニンの効率的な活性化にはファルシパインを介したヘモグロビンのタンパク質分解が必要であることが示されました 44。これらの結果は、ヘモグロビンから遊離した後のヘムによるアルテミシニンの毒性フリーラジカルへの変換が、アルテミシニンの効率的な作用の前提条件であるという我々の理解と一致している。興味深いことに、ファルシパイン-2a 終止コドンをコードする変異が、アルテミシニンに対する耐性について in vitro で選択された寄生虫で同定されましたが、この選択は PfK13 変異の出現後に発生しました 6。総合すると、入手可能なデータは、ファルシパイン-2a の特定の変異が、PfK13 の変異とは独立して、または PfK13 の変異と連携して、アルテミシニンの部分耐性を媒介できることを示唆しています。

セネガルの寄生虫の研究では、DHA濃度を増加させた熱帯熱マラリア原虫のin vitro選択により、PfK1310ではなくプフコロニンの変異に関連して生存率が向上した寄生虫が選択されました。 DHA 曝露後の生存に対するフコロニン変異の影響は、寄生虫の遺伝的背景に基づいて異なります 46。フコロニンは、アクチンフィラメントおよび細胞内膜と結合することが知られている WD40 プロペラドメインタンパク質ファミリーのメンバーです 47,48。アルテミシニンの部分耐性に対するプフコロニン変異の寄与の生物学的根拠は不明であるが、プフコロニン変異の影響は PfK13 変異によって隠蔽されていることが指摘されており、2 つのタンパク質の変異が同じ寄生虫機構に影響を与える可能性があることが示唆されている 46。

さらなる多型は、RSA 生存率の変化と関連していました。推定上の脱ユビキチン化酵素をコードする pfubp1 の欠失は、リング生存率の増加と関連していました。このタンパク質の P. Chabaudi ホモログにおける 2 つの変異は、マウスの遺伝的交雑におけるアルテミシニン耐性と関連していました 49。変異は、in vitro での熱帯熱マラリア原虫のアルテミシニン部分耐性 50 およびマウスの P. berghei のアルテミシニン部分耐性に関連していましたが、臨床的な部分耐性には関連していません 52。そして、このタンパク質はアフィニティー標識によって PfK1353 と会合していることが示されました。我々の結果は、PfUBP1 変異がアルテミシニン部分耐性の潜在的な二次メディエーターであることを特定するこれらの限られたデータを裏付けています。興味深いことに、15 個のプレプロペラドメイン PfK13 変異のいずれかの存在は、生存率の低下と関連していました。これらの結果は、おそらく逆説的ではあるが、これらの変異がアルテミシニン活性を増強し、プロペラドメイン変異とは逆の効果を示すことを示唆している。機能不明のタンパク質 (Pf3D7_1433800) の多型も生存率の増加と関連していました。このタンパク質の異なる多型は、プフコロニンを潜在的な耐性決定基として同定した同じ実験で選択されました 10 が、これはリング生存率の増加には寄与していないようです 46。

また、標準的な増殖阻害アッセイを使用して、7 種類の抗マラリア薬のパネルに対する熱帯熱マラリア原虫分離株の感受性を比較しました。 2021年の同じ期間に収集および研究された分離株のみを考慮すると、ルメファントリンとDHAという2つの薬物に対する感受性は、ウガンダ東部の分離株よりもウガンダ北部の分離株の方が低かった。 2015年から2021年に収集されたより大規模な分離株を考慮すると、9つの遺伝子の多型が野生型寄生虫と比較してルメファントリン感受性の変化と関連していた。これらの結果は、ルメファントリン感受性の変化の潜在的なメディエーター、またはルメファントリン感受性の変化に関連する因子を浮き彫りにしている。まず、PfK13 469Y および 675 V 変異は感受性の低下と強く関連しており、アルテミシニンに対する部分的な耐性がパートナー薬剤に対する感受性の低下と関連している可能性が強調されています。しかし、これらの結果は、ルメファントリン感受性の変化における PfK13 変異の因果関係を示すものではありません。第二に、推定上の薬物輸送体 PfMDR1 における 3 つの変異は、ルメファントリン感受性の変化と関連していました。これらのうちの 1 つである 86Y は、以前はアフリカで高い罹患率を示し、ルメファントリンへの曝露によって選択され 15、先行研究 31,32 と現在の分析では薬物感受性の増加と関連していました。第三に、推定ホスホリパーゼの変異はルメファントリン感受性の変化と関連していた。このタンパク質の変異は、プリマキンへの in vitro 曝露によって以前に選択されており、その薬剤に対する感受性の低下と関連していました 54。興味深いことに、別の予測された熱帯熱マラリア原虫ホスホリパーゼである PfPARE の機能喪失変異は、ペプスタチンエステルシリーズ 55 である MMV011438 および抗マラリア薬候補オキソボロール AN1376256 に対する感受性の低下と関連しており、これはおそらく細胞内薬物活性化の喪失によるものと考えられます。第 4 に、予測される熱帯熱マラリア原虫転写因子 ApiAP257 のさまざまな多型は、ルメファントリン感受性の増加と減少の両方に関連していました。このタンパク質のさまざまな変異は、化学遺伝学的スクリーニング 54 では抗マラリア薬として開発中の 3 つの異なる化合物に対する感受性の低下と関連し、ゲノムワイド関連研究 58 ではキニーネに対する感受性の低下と関連していました。第 5 に、推定薬物トランスポーター PfMRP1 および PfMRP2 の変異は、ルメファントリン感受性の変化と関連していました。 PfMRP1 の他の変異は、アフリカの寄生虫で報告されており、さまざまな研究でアルテメテル - ルメファントリンによる以前の治療 59、およびクロロキン、アルテミシニン、メフロキン、ルメファントリン、ピペラキン、および/または DHA に対する感受性の低下と関連していることが報告されています 60、61、62、63。 PfMRP2 上流プロモーターの欠失 64 およびコード配列の多くの多型 65 は、アミノキノリンに対する感受性の低下と関連していました。第六に、ヘモグロビナーゼ、システインプロテアーゼのファルシパイン-2aおよびファルシパイン-343、およびアスパラギン酸プロテアーゼのプラスメプシン-I66をコードする遺伝子内のSNPは、ルメファントリン活性の変化と関連していた。上で述べたように、酵素阻害または遺伝子ノックアウトによるファルシパイン-2a の活性低下はアルテミシニンに対する感受性の低下を引き起こし 44、他のヘモグロビナーゼの機能の変化もアルテミシニンの作用に影響を与える可能性があります。

ウガンダ北部で異常に高いルメファントリン IC50 を持つ寄生虫が同定されたことにより、この表現型の特徴付けに関心が集まりました。しかし、表現型は不安定であることが判明した。培養に適応した寄生虫を確立するために４週間以上培養下で寄生虫が増殖すると、ルメファントリンに対する感受性の増加が伴った。したがって、ルメファントリン感受性が低下したいくつかの寄生虫がウガンダ北部で循環しているようですが、この地域に通常存在する混合分離株では、感受性の低い株が培養中に薬剤感受性のより高い株と日常的に競合していると考えられます。感受性の低下表現型は、寄生虫の生体内と試験管内の増殖の間の説明できない環境の違いにより、試験管内では失われます。

私たちの研究にはいくつかの重要な制限がありました。まず、トロロ地区（約 400 km 離れたところ）にある私たちの研究室でアガゴ地区からの分離株を研究するという物流上の課題のため、RSA の寄生虫を 2 か月間のみ収集し、分析をウガンダ北部からの分離株 57 株に限定しました。第二に、同じ期間に収集された分離株の研究に関心があったため、ウガンダ東部の 42 株の RSA の分析に限定されました。サンプルサイズが限られているため、RSA 分析の能力も制限されていました。第三に、ウガンダ北部と東部からサンプルを提供した参加者はいくつかの点で異なっており、特にウガンダ東部からの参加者の方が年齢が低く、寄生虫症が高かった。ただし、これらの違いが薬物感受性の ex vivo 測定に影響を与えるとは予想されません。第 4 に、分離株は通常、アフリカの高伝播地域の感染症に典型的なポリクローナル性でした。 Ex vivo IC50 は必然的にサンプル中のクローンの活性の平均を表しており、ゲノム分析では少数クローンのいくつかの配列が見逃されている可能性があります。第 5 に、我々のマルチプレックスディープシークエンシングアプローチでは、不完全なタイリングまたは不適切なバランスの PCR 条件により、一部の遺伝子の一部の解析が制限されました。第六に、我々の研究は標的遺伝子に限定されており、薬剤感受性に関連するゲノム全体の変異を完全に特徴付けることができませんでした。この点では、ゲノムワイド関連研究や遺伝的交配などの追加研究が役立つでしょう。これらの制限にもかかわらず、特定された強力な関連性は有効であると我々は考えていますが、広い地理的範囲にわたって収集された多数の分離株の追加研究が確かに優先度が高いです。

ウガンダ北部で流行している熱帯熱マラリア原虫に対するアルテミシニンとルメファントリンの両方の活性低下の臨床的影響は不明です。 PfK13 469Y および 675 V 変異を持つ寄生虫の排除は、アルテスネートの静脈内投与後、野生型寄生虫の排除と比較して遅れました 22。この結果は、変異原虫によって引き起こされる重度のマラリアの治療に対する反応が遅く、重篤な罹患率と死亡率の増加につながる可能性があることを示唆しています。ルワンダでは、アルテメテル・ルメファントリンによる治療後、異なる PfK13 変異である 561H を持つ寄生虫の排除が野生型寄生虫の排除に比べて遅れたが、標準的な方法で評価された治療効果は、変異型寄生虫と野生型寄生虫に感染した患者の間で差はなかった17。。ウガンダの 469Y および 675V 変異が ACT の治療効果に及ぼす影響は不明です。しかし、我々のデータが示唆するように、アルテミシニンとルメファントリンに対する反応の変化は、ウガンダやアフリカのほとんどのマラリア常在国における第一選択の抗マラリア薬であるアルテメーテル・ルメファントリンによる治療に対する反応に影響を与える可能性が高いと思われる。したがって、PfK13変異原虫が生息する地域における、重篤なマラリアを治療するためのアルテスネート静脈内投与と、合併症のないマラリアを治療するためのアルテメーテル・ルメファントリンの抗マラリア効果に関する研究が最優先である。

RSA および増殖阻害アッセイを含む評価のために、サンプルは 2021 年 5 月 31 日から 8 月 17 日までに 3 つのサイトから採取されました。トロロ地区病院、ウガンダ東部トロロ地区。そして同じくウガンダ東部のムバレ地区にあるブシウ保健センター IV です (図 1)。増殖阻害アッセイのみを含む評価の場合、サンプルは、前述のウガンダ東部の施設および同様にウガンダ東部のブシア地区のマサフ病院から 2015 年 12 月から 2021 年 8 月にかけて採取されました 32。パトンゴ保健センターの場合、サンプルは週に 2 回収集され、収集日にトロロの研究所に輸送されました。ウガンダ東部のサイトからサンプルが入手可能なものとして毎日収集されました。分離株は、マラリアの臨床症状があり、ギムザ染色血液フィルムが陽性の熱帯熱マラリア原虫を示し、重篤な疾患の兆候が見られない生後6か月以上の患者から採取されました。過去 30 日以内に抗マラリア治療の使用を報告した患者、または他のマラリア原虫種による感染の証拠がある患者は除外されました。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 18 歳未満の子供の親または保護者が、子供に代わって書面による同意を提供した。 8 ～ 17 歳の子供が同意しました。治療開始前に、2 ～ 5 mL の静脈血をヘパリンチューブに採取しました。参加者にはサンプル採取後、国のガイドラインに従ってアルテメーテル・ルメファントリンが投与された。この研究はマケレレ大学研究倫理委員会、ウガンダ国家科学技術評議会、カリフォルニア大学サンフランシスコ校人間研究委員会によって承認された。

寄生虫血症は、100倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用し、1000個以上の赤血球を計数し、ギムザ染色された薄膜によって同定された。物流上の考慮事項 (サンプルは 1 日の異なる時間に、異なる場所から収集される) により、サンプルは 4 °C で保管され、通常はサンプル収集の翌朝に培養が開始されました。寄生虫は、前述のように培養液に置かれました 32。血液を室温で10分間遠心分離し、血漿と軟膜を除去し、赤血球ペレットをRPMI 1640培地（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で37℃で3回洗浄しました。ペレットを、25 mM HEPES、24 mM NaHCO3、0.1 mM ヒポキサンチン、10 μg/mL ゲンタマイシン、および 0.5% AlbuMAX II (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を含む RPMI 1640 からなる完全培地に再懸濁して、ヘマトクリットを生成しました。 50％。さらに、その後の分子分析のために、約 10 μL の洗浄ペレットの 4 つのアリコートを Whatman 3MM 濾紙 (Cytivia、米国マサチューセッツ州マールボロ) 上にスポットしました。

薬物感受性は、前述のように、SYBR Green 検出を備えた 72 時間マイクロプレート増殖阻害アッセイを使用して、最小 0.3% の寄生虫血症を含むサンプルで評価されました 32。 Medicines for Malaria Venture によって供給された研究化合物 (クロロキン、モノデスエチルアモジアキン、ピペラキン、ルメファントリン、メフロキン、ジヒドロアルテミシニン、およびピロナリジン) は、10 mM ストックとしてジメチルスルホキシド (クロロキン用の蒸留水を除く) に溶解され、-20 °C で保存されました。薬物は、完全な用量反応曲線を捉えるために最適化された濃度で、薬物および寄生虫のない対照ウェルを含む、96 ウェルマイクロプレート内の完全培地 (ウェルあたり 50 μL) で 3 倍に連続希釈しました。培養物を地元の血液銀行からの未感染赤血球で希釈し、0.2%寄生虫血症および2%ヘマトクリットでウェル当たり総量200μLとした。プレートを加湿モジュラーインキュベーター (Billups Rothenberg、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) 内で 5% CO2、5% O2、および 90% N2 で 37 °C で 72 時間維持しました。 72 時間後、ウェル内容物を再懸濁し、ウェルあたり 100 μL の培養物を、SYBR Green 溶解バッファー (20 mM Tris、5 mM EDTA、0.008% サポニン、0.08% Triton X-100) を含む黒色の 96 ウェルプレートに移しました。、および０．２μＬ／ｍＬＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム））を混合した。プレートを室温の暗所で１時間インキュベートし、次いで、ＦＬＵＯｓｔａｒＯｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧＬａｂＴｅｃｈ、米国ノースカロライナ州ケアリー、励起４８５ｎｍ、発光５３０ｎｍ）で蛍光を測定した。薬剤ストックの安定性を監視するために、実験室対照の熱帯熱マラリア原虫 Dd2 (MRA-156) および 3D7 (MRA-102) 株 (BEI Resources、バージニア州マナッサス) を培養下に維持し、(リング段階から開始して) およそのアッセイを行いました。磁気カラム (Miltenyi Biotec、米国カリフォルニア州オーバーン) との同期後、毎月。寄生虫を長期培養に適応させるため、新たに収集した分離株を、必要に応じてドナー赤血球を使用して1％寄生虫血症まで希釈し、上記の条件下でRPMI完全培地中で2％ヘマトクリットで培養しました。必要に応じて、培養物を非感染赤血球で希釈しました。約 4 週間後、環状寄生虫をグリセロライト 57 溶液 (Frensenius Kabi AG、ハンブルク、ドイツ) 中で凍結保存し、気相液体窒素中で保存しました。

標準的な増殖阻害アッセイでは、アルテミシニン耐性寄生虫に関連する臨床的なクリアランス遅延は予測できません。したがって、DHA 感受性は、以前に記載されているように、ex vivo RSA を使用して測定されました 67。簡単に説明すると、増殖阻害アッセイについて上記のように調製した、最小0.2%の寄生虫血症を有する新たに培養した寄生虫を、700 nM DHAまたは対照の場合は0.1% DMSOとともに6時間インキュベートした。 1%を超える寄生虫血症を伴う分離株は1%に希釈されました。寄生虫血症が1%以下の分離株は、寄生虫血症の開始時に培養されました。 6 時間後に細胞を洗浄して薬物を除去し、さらに 66 時間培養を続けました。培養開始から 72 時間後に、ギムザ染色した薄い塗抹標本を作成しました。対照寄生虫血症が開始寄生虫血症の 0.2% 以上、かつ 25% 以上であれば、培養物は生存可能であり、評価に適切であるとみなされました。対照培養物および処理培養物中の寄生虫血症を計数し、対照と比較したDHA処理培養物中の生存可能な寄生虫の割合としてRSA生存率を表した。

遺伝子配列とコピー数は、以前に記載されているように、MIP キャプチャとディープシークエンシングによって分析されました 21、32、68。 MIP捕捉では、以前に公開されたプローブと新しく設計されたプローブ（補足表9）を使用して、標準的な抗マラリア薬または開発中の化合物に対する感受性の変化における既知または潜在的な役割のために選択された合計80の遺伝子（補足表1）をターゲットにしました（補足表9）。新しいプローブは、MIPTools ソフトウェア (バージョン 0.19.12.13) を使用して設計されました。以前に報告されているように、サポニン 21 の代わりに 0.01% Tween 20 を使用して、Chelex-100 抽出バッファーで DNA を単離しました。 MIP の捕捉、ライブラリーの調製、および配列決定は、前述のように実行されました 68。シーケンスリードは、National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (アクセッション番号 PRJNA850445) で入手できます。 MIPTools は、生のシーケンスデータを整理し、バリアント呼び出しを実行するために使用されました。個々の遺伝子型は、少なくとも 10 個の固有分子識別子 (UMI) でカバーされる多型部位に割り当てられ、変異体は、サンプル内の対立遺伝子数が代替対立遺伝子の場合は 3 UMI 以上、参照対立遺伝子の場合は 2 UMI 以上である必要がありました。コピー数は、pfmdr1 の 31 個の固有のプローブとプラスメプシン 2/3 の 21 個のプローブからのサンプルとプローブの正規化された配列範囲の深さに基づいて推定されました。増幅された pfmdr1 を含み、プラスメプシン 2/3 のコピーが 1 つである Dd2 株と、プラスメプシン 269 のコピーが複数ある KH001_053 の G8 サブクローン (Selina Bopp と TRAC の協力によりご提供いただきました) をコントロールとして使用しました。感染の複雑さ（COI）は、サンプルの対立遺伝子頻度と COI を推定するマルコフ連鎖モンテカルロモデルである THE REAL McCOIL を使用した MIP シーケンスによって生成されたジェノタイピングデータから推定されました 70。

IC50 値は、以前に説明したように、薬物濃度の対数に対して蛍光強度をプロットすることによって導出され、Prism (バージョン 9.0) の 4 パラメーターの Hill 方程式を使用して非線形曲線に当てはめました。追加の分析はすべて R (バージョン 4.1.2) で行われました。カテゴリデータは、両側のフィッシャーの直接検定と、増殖阻害アッセイおよび RSA を含む連続データを使用して両側のマン-ホイットニーウィルコクソン検定を使用して評価されました。 IC50 データの評価では、遺伝子型をバイナリ変数として考慮し、マイナー対立遺伝子の有無によって決定しました (混合および純粋なマイナー対立遺伝子の遺伝子型を組み合わせた)。 P ≤ 0.01 を有意であるとみなしました。 RSA 生存率については、マイナーアレルの有病率が高い (>15%) 遺伝子座を上記のように独立して評価し、マイナーアレルの有病率が低い (15% 以下) 遺伝子座を集合変数として分析しました。主要対立遺伝子と比較しました。高有病率遺伝子座と低有病率遺伝子座の両方について、p ≤ 0.05 が有意であるとみなされました。統計的に有意な遺伝子座については、K13 C469Y および A675V 変異と関連して RSA 生存率も評価されました。候補遺伝子座および K13 遺伝子型は、上記のようにバイナリ変数として扱われました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

すべての関連データは、要求に応じて対応する著者から入手できます。配列データは、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) Sequence Read Archive (アクセッション番号 PRJNA850445) で入手できます。データとコードは https://github.com/PJRosenthalLab/2022_Tumwebaze_NatCom で入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、国立衛生研究所（AI075045 (PJR)、AI089674 (PJR)、TW007375 (PJR)、および AI139520 (JAB)) および Medicines for Malaria Venture (RD/15/0001 (PJR)) の資金提供を受けました。研究参加者とサンプルを収集した診療所のスタッフに感謝します。コピー数コントロールとして KH001_053 クローンを提供してくださった Selina Bopp、Sarah Volkman、および TRAC コラボレーションのメンバーに感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Patrick K. Tumwebaze、Melissa D. Conrad。

感染症研究協力、ウガンダ、カンパラ

パトリック・K・タムウェベイズ、スティーブン・オキトゥイ、スティーブン・オレナ、オズワルド・ビャルハンガ、トーマス・カタイロ、サミュエル・L・ンソビア

カリフォルニア大学、サンフランシスコ、米国カリフォルニア州

メリッサ・D・コンラッド、ジェニファー・レガック、シュリーヤ・ガーグ、フィリップ・J・ローゼンタール

ブラウン大学、プロビデンス、ロードアイランド州、米国

デヴィッド・ギースブレヒト、ソーヤー・R・スミス、ジェフリー・A・ベイリー

ドミニカンカリフォルニア大学、サンラファエル、カリフォルニア州、米国

フリーダ・G・セハ & ローランド・A・クーパー

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著者全員が実験を考案し、設計しました。 PKT、MDC、MO、SO、OB、TK、JL、SG、DG、SRS、FGC、および RAC がデータを取得しました。 PKT、MDC、MO、SO、TK、SG、DG、JAB、RAC、および PJR がデータを分析および解釈しました。 PKT、MDC、SLN、JAB、RAC、および PJR が原稿の執筆において主要な役割を果たしました。著者全員が最終原稿を承認しました。

メリッサ D. コンラッドまたはフィリップ J. ローゼンタールとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献した Colin Sutherland、Didier Menard、Dulcie Lautu-Gumal、およびその他の匿名の査読者に感謝します。査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

PK さん、コンラッドさん、MD さん、Okitwi さん、M さん、ありがとう。ウガンダ北部におけるジヒドロアルテミシニンとルメファントリンの両方に対する熱帯熱マラリア原虫の感受性の低下。 Nat Commun 13、6353 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-33873-x

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受信日: 2022 年 6 月 23 日

受理日: 2022 年 10 月 6 日

公開日: 2022 年 10 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33873-x

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マラリアジャーナル (2023)

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