TadA バリアントから生成された改良されたシトシン塩基エディター - 済南クリアオーシャンテクノロジーズ株式会社

Nature Biotechnology volume 41、pages 686–697 (2023)この記事を引用

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50 オルトメトリック

メトリクスの詳細

シトシン塩基エディター (CBE) は、プログラム可能なゲノム C・G から T・A への遷移突然変異を可能にし、通常、修飾された CRISPR-Cas 酵素、天然に存在するシチジンデアミナーゼ、およびウラシル修復の阻害剤で構成されます。これまでの研究では、天然に存在するシチジンデアミナーゼを利用する CBE が、誘導されずにゲノム全体のシトシン脱アミノ化を引き起こす可能性があることが示されています。その後、確率論的なゲノム全体のオフターゲットを減少させる改善された CBE が報告されましたが、これらのエディターは最適ではないオンターゲットのパフォーマンスに悩まされる可能性があります。ここでは、ゲノム遺伝子座の配列が多様なセットにわたって高いオンターゲット C・G から T・A を可能にし、初代細胞で強力な活性を示す TadA の改変変異体 (CBE-T) を使用した CBE の生成と特性評価を報告します。また、ゲノム全体の突然変異の検出可能な上昇は引き起こされません。さらに、A-to-I 編集と C-to-U 編集 (CABE-T) の両方を触媒するシトシンおよびアデニン塩基エディター (CABE) についても報告します。 ABE と合わせて、CBE-T および CABE-T を使用すると、以前に報告された CBE と比較して特性が向上した研究室で進化した TadA 変異体を使用して、すべての遷移変異をプログラム可能にインストールできます。

シトシン塩基エディター (CBE) は、生細胞のゲノム DNA に C・G から T・A への塩基対の変更をプログラム的に導入できる遺伝子編集酵素です。この化学変換は、酵素を介したシトシンのウラシルへの加水分解脱アミノ化によって達成され、これは DNA ポリメラーゼによってチミンとして解釈されます 1。現在まで、CBE は通常 4 つの異なる構成要素で構成されています。天然に存在するシチジンデアミナーゼ (APOBEC、AID、CDA など)2、塩基編集されていない DNA 鎖にニックを入れることができる Cas9 の障害型、1 つまたは複数のユニットです。ウラシルグリコシラーゼ阻害剤 (UGI) ペプチドと核局在化配列 (NLS) の解析。これらのコンポーネントは通常、共有結合で融合されますが、非共有結合で組み立てられることもあります4。 CBE は遺伝子復帰や細胞工学に広く利用されており、衰弱性の遺伝性疾患や悪性腫瘍を抱える患者に治療効果をもたらす可能性があります 5。

現在の CBE 塩基編集ツールでは高いオンターゲット DNA 編集効率を達成できますが 2、ゲノム全体にわたる確率論的なガイド RNA (gRNA) に依存しないオフターゲット編集を引き起こす可能性もあります 6,7。 YE1 (参考文献 8)、BE4-PpAPOBEC9 などの次世代 CBE エディター 10 は、gRNA 非依存性のオフターゲット結果を軽減することが報告されていますが、これらのエディターは APOBEC デアミナーゼの天然または軽度に改変されたバリアントを使用しているため、 -ターゲット編集パフォーマンス2、9。さらに、一部の配列特異的な状況では、APOBEC の非効率ではあるが測定可能な二本鎖 DNA (dsDNA) を基質として受け入れる能力により、APOBEC ベースの CBE は、標的ゲノム配列に隣接する近位編集を引き起こす可能性があります 11。

アデニン塩基エディター (ABE) は、アデニンをイノシンに化学的に変換する研究室で開発された TadA デアミナーゼを介して、標的遺伝子座に A・T から G・C への点変異をプログラム可能に導入する遺伝子編集酵素です12。 DNAポリメラーゼの活性部位内でイノシン塩基対がシトシンと結合し、DNA複製後にイノシンからグアニンへの変異が生じます。注目すべきことに、ABE は gRNA 非依存性のオフターゲットをほとんどまたはまったく引き起こさず、より正確な範囲 (位置 ~3 ～ 8、PAM 21 ～ 23) 内でゲノム DNA (gDNA) を編集するため、ガイド依存性のオフターゲットが少なくなる可能性があります。 CBE 6、13 と比較して、傍観者の編集が少なくなります。さらに、ABE が dsDNA に作用することは報告されていません。

CBEにABEの有利な属性を与えるために、我々はTadAを強力なシチジン脱アミノ化が可能な酵素に変換することを構想し、その後、天然に存在するシチジンデアミナーゼの代わりにTadAを使用する改良されたクラスのCBEを生成しました。心強いことには、これまでの研究で、UGI14 を含めることにより、低いながらも検出可能な C to T 編集に対する ABE の展性が実証されています。実際、構造誘導設計により、ABE7.10 と比較してシトシン活性の増強を可能にする ABE 変異体 ABE-P48R-UGI が報告されていますが、高い TC 配列特異性を備えています 15。これらの進歩は私たちの目的に向けた進歩を表していますが、高い生成物純度で基質配列の制限なしに治療に関連するC・G-to-T・A編集効率を達成するには、TadAのさらなるエンジニアリングと進化が必要であることを認識しました。

ライブラリー生成のテンプレートとして ABE8.20-m13 から始めて、C・G から T・A への編集効率が向上し、アデニン編集が保持されるベースエディターバリアントを生成するために、2 ラウンドの有向進化を実施しました。我々は、TadAを利用するこれらのシトシンおよびアデニン塩基エディター（CABE）を「CABE-T」と呼び、C・G-to-T・AおよびA・T-to-G・C編集効率に関してこれらのエディターをさらに開発および特徴付けしました。哺乳動物の細胞では。 CABE-T を入手して、これらのエディターに関連する TadA デアミナーゼ変異体の結晶構造を決定し、構造誘導突然変異誘発を実行して、高 C·G ～ T· 向けに操作された TadA デアミナーゼを使用する CBE の異なるクラスである CBE-T を作成しました。感知できるレベルの A・T から G・C への編集を伴わない gDNA の変換。 BE4と比較して、当社のCBE-Tは同等のオンターゲット編集効率を示し、より正確な編集ウィンドウを持ち、ガイド依存のオフターゲット編集を減少させ、検出可能なgRNA非依存性のゲノムワイドのオフターゲット編集を示さなかった。さらに、CBE-T は直交 Cas 酵素との適合性を示し、より広範囲の標的部位にわたる潜在的な応用を可能にしました。最後に、当社の CBE-T は、T 細胞や肝細胞などの初代細胞タイプで非常に活性が高かったため、治療用途のための魅力的な遺伝子編集ツールとしての可能性が実証されました。

ABE の核酸塩基基質耐性を変更するために、我々は、ABE に選択的に圧力をかけて、その低いが検出可能な 13,14 C・G-to-T・A 塩基編集能力を、指向性進化と UGI の組み込み（ウラシルを阻害するため）によって高めることができると推論した。 UNG2による修理）。まず、エディターの TadA 領域で化学的にランダム化された (ABE8.20-m13 をテンプレートとして使用)、またはエラープローン PCR によってランダム化された (ABE8.19-m13 をテンプレートとして使用) ABE ライブラリーを生成しました。結果として得られた約 1,000 万人のメンバーのライブラリには、メンバーごとに平均 3 つのアミノ酸置換が含まれていました。大腸菌をABEライブラリー、gRNA、および選択プラスミドで同時形質転換し、その後、対応する抗生物質耐性内でC・GからT・Aへの編集を実行し、遺伝子を回復するABEライブラリーのメンバーに対して選択された致死量の抗生物質でチャレンジしました。機能（図1a〜dおよび補足シーケンス1）。生き残ったライブラリーメンバーのサンガー配列分析（図1eおよび補足図1）により、抗生物質で選択されたクローンの大部分がTadAの27位と49位にアミノ酸置換を含んでいることが明らかになりました。 20 個の変異体のうち 19 個はいずれかの位置に少なくとも 1 つの置換を含むため、基質結合ポケットの近くに位置するこれらの位置 (E27H および I49K) での置換が構造変化を誘導し、TadA がシトシン核酸塩基に結合して脱アミノ化できるようにするのではないかと仮説を立てました。アデニンよりもサイズが小さい。

a、C-to-U 脱アミノ化が可能な TadA 変異体を同定するための指向性進化ワークフローの概略図。 b、指向性進化キャンペーンで使用される発現および選択プラスミドの概略図。左: ライブラリーメンバーおよび sgRNA をコードするベースエディター発現プラスミド、右: 機能しない抗生物質耐性遺伝子をコードする選択プラスミド。標的部位での復帰により遺伝子機能が回復します。 c. 指向性進化とタンパク質工学による CBE-T エディター開発の概要。 d. 選択されたベースエディターアーキテクチャの概略図。 ABE12 には、研究室で進化した TadA* デアミナーゼ、nCas9 (D10A) および核局在化タグ (bpNLS) が含まれています。デュアルエディター (SPACE16 など) は、進化した TadA* デアミナーゼ、nCas9 (D10A)、シチジンデアミナーゼ rAPOBEC1 と、2 ユニットの UGI および bpNLS タグで構成されます。 CBE（たとえば、BE4（参考文献3））は、天然に存在するシチジンデアミナーゼ（たとえば、rAPOBEC1）、nCas9 D10A、2ユニットのUGI、およびbpNLSタグで構成されています。ここで報告される CABE-T は、A-to-G および C-to-T 編集が可能な TadA バリアント (TADAC)、nCas9 (D10A)、2 ユニットの UGI、および bpNLS タグで構成されています。ここで報告される CBE-T は、C-to-T 編集が可能な TadA バリアント (TADC)、nCas9 (D10A)、2 ユニットの UGI、および bpNLS タグで構成されています。 e、有向進化ラウンド 1 (CABE-T1) およびラウンド 2 (CABE-T2) から選択された CABE-T エディターで TadA に組み込まれた置換。野生型 (WT) TadA に関連して TadA*8.20 に組み込まれた置換は灰色で強調表示され、定向進化ラウンド 1 および 2 で同定された置換はそれぞれ紫とオレンジで強調表示されます。最後の列の値は、WT TadA と比較した各バリアントに追加された置換の数を表します。 f、CABE-T1およびCABE-T2エディターまたはコントロールをコードするヒト発現プラスミドでトランスフェクトされたHEK293T細胞における最大のC・GからT・AおよびA・TからG・Cへの変換。値とエラーバーは、異なる日に実行された n = 3 (サイト 1 ～ 4) または 4 (サイト 5 および 6) の独立した生物学的複製の平均と標準偏差を反映しています。

ソースデータ

生き残ったライブラリーメンバーのうち、20 個の変異体が塩基編集の結果について哺乳類細胞で特徴付けられ、進化の第 1 ラウンドで特定された多くの変異体は、かなりのレベルの C・G から T・A 編集を示しました (たとえば、CABE-T1.2、avg 32.1％; CABE-T1.17、22のゲノム部位全体で平均34.9％）、さまざまな程度のA・TからG・C編集が保持されました（図1fおよび補足図2〜4）。構造的には、これらの塩基エディターは、Cas9ニッカーゼ（nCas9、D10A）のN末端に共有結合したTadA変異体、その後に2つのC末端UGIユニットと核局在化タグが続いて構成されています（図1d）。したがって、これらのデュアルA・TからG・CおよびC・GからT・AエディターをCABE-T1と呼びます（図1c）。 CABE-T1は、テストしたゲノム部位でABE8.20-mと比較して平均25倍を超えるC・GからT・A編集の増加を誘発しました（図1fおよび補足図2〜4）。

CABE-T1 の全体的な編集効率をさらに高めるために、CABE-T1.2 のバックグラウンド配列上に約 1,000 万メンバーの CABE-T ライブラリーを作成しました。CABE-T1 は、堅牢な C・G から T・A までを実証しました。哺乳動物細胞での編集（図1f）。 CABE-T1.2 ライブラリーメンバーには、選択の厳密性を高めるための 2 つの A・T から G・C 編集に加えて、2 つの C・G から T・A への復帰を作成する必要がありました。方向進化の前のラウンド（図1bおよび補足シーケンス2）。 CABE-T2バリアントと呼ばれる、生き残ったライブラリメンバーの配列が同定され、哺乳類細胞における塩基編集効率と核酸塩基基質の偏りが評価されました（図1e、fおよび補足図5）。全体として、哺乳動物のトランスフェクション実験では、CABE-T1 よりも CABE-T2 の改善が明らかになりました。たとえば、代表的なバリアント CABE-T2.6、CABE-T2.9、および CABE-T2.19 は、22 のゲノム部位にわたって平均最大 C・G 対 T・A 編集率 53.0%、53.6%、および 49.4% を達成することができました。、それぞれ、さまざまなレベルのA・TからG・C編集も維持します（図1fおよび補足図2、3、および6）。

CABE は以前に文献で報告されていますが、これらのツールには、単一の全長エディターからアデニンおよびシトシン塩基の編集を可能にするために、TadA*7.10 と rAPOBEC1 デアミナーゼの両方を組み込む必要がありました 16、17、18、19。 DNA アデニンとシトシンの両方に作用する 1 つの TadA バリアント (TADAC) を使用する CABE-T の作成により、以前に記載された CABE と比較して優れた二重塩基編集結果を備えた、よりコンパクトな塩基エディター (約 700 bp 小さい) が生成されました。たとえば、CABE-T2.6は、SPACE16、A&C-BEmax17、およびTargetACEmax18と比較して、T・Aに対する最大C・Gが約1.6倍高いこと、およびG・Cに対する最大A・Tが約2.6倍高いことを実証しました（図1fおよび補足図2および3)。

方向性進化から同定されたアミノ酸置換がTADACの基質耐性にどのように影響するかを明らかにするために、CABE-T1の進化に使用されたテンプレートであるABE8.20-m13からTadA * 8.20の結晶構造を決定し、ここで報告するCABE-T1からのTADAC-1バリアントを決定しました。。構造的洞察を利用して、構造に基づいたライブラリー設計を通じて C・G-to-T・A 編集効率と基質特異性を最適化することを目指しました。

方向性進化の第 1 ラウンドに続いて、我々は、かなりのレベルの C・G から T・A 塩基編集を生成する CABE-T1 に対応する 3 つのデアミナーゼ (TADAC-1.17、TADAC-1.14、および TADAC-1.19) を構造的に特徴付けました。これらの変異体の全体構造はTadA * 8.20の構造と類似していますが（図2a）、構造分析により、CABE-T1変異体によって示される観察された基質耐性の拡大を説明できる可能性のある局所的な構造変化が明らかになりました。

a、TadA*8.20 と TADAC-1 変異体のモノマー間の重ね合わせ (すべての Cα 原子の RMSD は 0.4 Å ～ 0.9 Å)。 TADAC-1.17 (タンパク質 - 青、ssDNA - オレンジ) と TadA*8.20 (タンパク質 - 緑、ssDNA - 黄色) の構造は類似しており (すべての Cα 原子の RMSD が 0.4 Å)、置換 (シアン球) がどちらでもないことを示しています。タンパク質の構造や ssDNA 結合モードは変化しますが、活性部位の置換 S82T により触媒作用に影響を与える可能性があります。 TADAC-1.14 構造 (黄色) は、置換 G112H (マゼンタ球) により、β4 と β5 (マゼンタ) の間のループの立体構造が TadA*8.20 とは異なります。 TADAC-1.19 構造 (ピンク) には、α1 と β1 (オレンジ) の間に拡張ループがあり、置換 E27G (オレンジの球) により TadA*8.20 とは立体構造が異なります。 CはC末端を表す。 b、TadA * 8.20 および TADAC-1 変異体の活性部位空洞の表面。 TADAC-1.17 (2 番目のパネル) は、TadA*8.20 (1 番目のパネル) と比較して違いを示しません。 β4 と β5 の間の TADAC-1.14 ループ (3 番目のパネル) は活性部位空洞の形状を変化させ、A109 を TadA*8.20-ssDNA の dT(8) と立体的に衝突させます。 α1とβ1の間のTADAC-1.19ループ(4番目のパネル)は活性部位空洞の形状を変化させ、残基R26をTadA*8.20-ssDNAのdC(10)と立体的に衝突させる。 c、亜鉛イオン（灰色の球）に配位したアデニン遷移状態類似体2-デオキシ-8-アザンブラリン（d8Az;黄色）を有するTADAC-1.17活性部位。Ｔ８２は、触媒残基Ｅ５９から４Å（シアンの破線）離れている。黒い破線は水素結合を示します。 d, 基質を含まない TADAC-1.14 モノマー (明るい黄色と濃い黄色) と ssDNA 結合 TadA*8.20 モノマー (タンパク質 - 緑色、ssDNA - 黄色) の重ね合わせ。β4 と β5 (ピンク) の間の TADAC-1.14 ループの 2 つの異なる立体配座を示します。マゼンタ) TadA*8.20 と比較。このループには置換 G112H が含まれており、その新しい立体配座は dT(8) と立体衝突を起こします。 K49 は ssDNA 骨格 (dC(10) 骨格から約 4.5 Å) の近くにあり、タンパク質 - DNA 複合体の安定化に寄与している可能性があります。 e, 基質を含まない TADAC-1.19 (ピンク) と ssDNA 結合 TadA * 8.20 モノマーの重ね合わせ。E27G 置換により、TADAC-1.19 (オレンジ) の E25 が TadA * 8.20 (緑色) の E27 と同様の位置に配置され、 α1 と β1 の間の TADAC-1.19 ループの新しい立体構造 (オレンジ色)。破線は水素結合を示します。

TadA * 8.20およびTADAC-1.17の結晶構造は、アデニン遷移状態類似体である2-デオキシ-8-アザネブラリン（d8Az）を含むssDNA基質との複合体で決定されました（図2、拡張データ図1および2、および補足図） .7–10）。これら2つの構造は非常に類似しており、進化に由来する4つのTADAC-1.17置換（T17A、A48G、S82TおよびA142E）は、タンパク質構造やssDNA結合モードの変化によって基質耐性を劇的に変えることはありません（図2a、b）。これらの所見は、CABE-T1の他の変異体と比較して、TADAC-1.17のゲノム部位5におけるC・GからT・Aへの復帰が比較的低いことと相関しています（補足図4）。我々は、活性部位の触媒性E59残基（約4Å）近くのT82側鎖が、E59への、またはE59からのプロトン移動を調節することによってシトシンの脱アミノ化の増加に役割を果たしている可能性があると仮説を立てています（図2c）。さらに、TADAC-1.17構造におけるF156とdT（8）の間の相互作用で例示されるように、E142とR153の間の水素結合は、α6ヘリックスを安定化することによってssDNA結合を調節する可能性があります（拡張データ図2d）。

特に、4つの置換（S2H、I49K、Y76I、およびG112H）を含むTADAC-1.14の結晶構造は、活性部位キャビティの右側にある鎖β4とβ5（R107からV130）の間のループの構造の違いを明らかにしています（図1）。 2a、d、拡張データ図 3 および補足図 11)。このループには、かさばる正に荷電した残基を導入することによって、TadA * 8.20 と比較してその柔軟性と立体構造を劇的に変化させる G112H 置換が含まれています (拡張データ図 3d)。これらの構造変化は、アデニンとシトシンの両方を収容できるようにTADAC-1.14活性部位の空洞を再形成する可能性があります（図2bおよび拡張データ図3f）。実際、ssDNA基質に結合したTadA * 8.20の構造との比較は、TADAC-1.14が厳密なアデニン特異性を持つTadA変異体とは異なる方法でssDNAに結合する可能性があることを示しています（図2bおよび拡張データ図3d）。我々は、TADAC-1.14内の残基K49が核酸塩基dC（10）（〜4.5Å）近くに再配置されるため、シトシン含有ssDNA基質の結合に必要なタンパク質-DNA相互作用の安定化に寄与している可能性があると仮説を立てています（図2dおよび拡張データ図） .3e)。

TADAC-1.14 活性部位空洞の右側の摂動に加えて、TADAC-1.19 構造の評価により、私たちの進化による他の置換 (E27G および I49N) が活性部位空洞の左側に大きな構造変化を引き起こしたことが明らかになりました。 (図2a、b、拡張データ図4および補足図12)。これらの構造変化は、E27G 置換によって引き起こされる可能性が高く、その結果、E27 と A48、I49 および G50 の間の必須の水素結合が失われます。これらの水素結合の損失により、TADAC-1.19の残基E25を、以前はTadA * 8.20の残基E27が占めていた同様の位置に再配向する構造変化が発生しました（図2eおよび拡張データ図4e）。 E25の置換により、α1ヘリックスが短縮され、E27G置換を含むα1とβ1（D24からP29）の間のループの長さと立体構造が変化し、α5ヘリックスとα6ヘリックスが展開されます（図2a、eおよび拡張データ図）。 4）、TADAC-T1.19活性部位の空洞を再形成し、活性部位内の標的核酸塩基の結合に影響を与える可能性があります（図2b）。

ここで説明した結晶構造 (図 2) から情報を得て、我々は、TadA*8.20 の 3 つの異なる領域 (E27G、S82T、および G112H) の 1 つにおける置換によって誘発される構造変化が、シトシンに対する基質耐性を変化させるのに十分であると推測しました (図 2)。 3b)。したがって、我々は、3 つの領域すべてのアミノ酸置換を組み合わせると、C・G から T・A への編集を強化する際に相乗的な改善がもたらされるのではないかと仮説を立てました。この仮説を検証するために、CABE-T1 のデアミナーゼ内の 8 つの部位がライブラリ構築用に選択されました。これには、上記で説明した 27、49、82、112、および 142 位の置換と、TadA* の活性部位またはその近くで合理的に選択された 2 つの部位が含まれます。 8.20 (図 3a、b) を使用して、199 個のバリアント (CABE-T3) を含む最初の組み合わせライブラリを生成します。各ライブラリメンバーは、CABE-T3のデアミナーゼに2〜10のアミノ酸置換（平均〜5.3）を持ち、ほとんどのライブラリメンバーは、これらの3つの領域すべてで少なくとも1つのアミノ酸置換をコードしていました（図3b、cおよび補足図） .13および14）。我々は、いくつかの CABE-T3 変異体、特に CABE-T3.1 と CABE-T3.155 を特定しました。これらは、C·G-to-T·A および A·T-to-G·C 塩基編集活性を、 CABE-T1またはCABE-T2のものよりも高い（図3dおよび補足図2、3、および15）。特に、相対的な塩基編集活性について哺乳動物細胞内でライブラリーメンバーを直接スクリーニングすることにより、いくつかのバリアント（たとえば、CABE-T3.55、T3.153、およびT3.154）は、A・TからG・Cへの編集を最小限に抑えながら、C・GからT・Aへの編集で堅牢に機能します（補足図15）。

a、構造に基づいた組み合わせライブラリ設計ワークフロー。明確にするために、ssDNA (黄色) を持つ 1 つの TadA*8.20 モノマー (緑色) のみを示しています。進化の最初のラウンドで同定された 23 個の置換部位は、最初のパネルに紫色の球として示されています。 TADAC-1 バリアントの構造 (図 2) に基づいて、α1 と β1、α2 ヘリックス、活性部位の間のループ内で、TADAC-1 から 8 つ (紫) と合理的に選択された 2 つ (シアン) の合計 10 個の部位が選択されました。、β4 と β5 の間のループ、および α5-ヘリックスを使用して、TADAC-3 バリアントを生成します (2 番目のパネル)。進化の第 2 ラウンドからの TADAC-2 の置換部位は、TadA*8.20 構造内の紫色 (TADAC-1 で同定されたのと同じ部位) およびオレンジ色 (新しい部位) の球として示されています (3 番目のパネル)。 TADC-1 変異体を生成するために、進化の第 2 ラウンドからの 8 つの置換が TACAC-3.154 に追加されました (4 番目のパネル)。 b、TADAC-3を生成するために選択された置換部位を示すTadA*8.20構造(緑色)の別の図(紫色およびシアン色の球)。破線の円は、基質耐性を変えるために重要であると我々が仮説を立てた 3 つの領域を強調しています。 c、構造誘導スクリーニングラウンド 1 (CABE-T3 エディター、TADAC-3 デアミナーゼ) およびラウンド 2 (CBE-T1 エディター、TADC-1 デアミナーゼ) から選択された TadA に組み込まれた置換。 WT TadA と比較して TadA*8.20 に組み込まれた置換は灰色で強調表示され、定向進化キャンペーン 1 および 2 で同定された置換はそれぞれ紫とオレンジで強調表示されます。最後の列の値は、WT TadA と比較した各バリアントに追加された置換の数を表します。 d、CABE-T3およびCBE-T1ベースエディターまたはコントロールをコードするヒト発現プラスミドでトランスフェクトされたHEK293T細胞の標的ゲノム遺伝子座における最大のC・GからT・AおよびA・TからG・C変換。値とエラーバーは、異なる日に実行された n = 3 (サイト 1 ～ 4) または 4 (サイト 5 および 6) の独立した生物学的複製の平均と標準偏差を反映しています。

ソースデータ

同様に、全体的な C·G-to-T·A 編集効率をさらに高め、シトシンに対する基質特異性を最適化するために、C·G から T·A 編集に強い優先性を示すベースエディターである CABE-T3.154 を採用しました（補足）図14および15）、およびCABE-T2のデアミナーゼから選択された8つの追加置換を組み合わせて階層化しました（図3および補足図5および6）。これらの置換はデアミナーゼの DNA 結合ポケットの近位に位置しており、CABE-T2 にそれらが含まれることにより、CABE-T1 と比較して編集効率が全体的に増加しました。我々は56メンバーのライブラリーを生成し（補足図16）、プラスミドトランスフェクションを介して哺乳類細胞でそれらをスクリーニングしたところ、56の変異体すべてが実質的なC・GからT・Aへの編集（全変異体全体で平均69.2％）を達成したが、原因はわずかであったことを発見した。低レベルから検出不可能なレベルのA・TからG・Cへの編集（テストされたすべての部位のすべてのバリアントの平均1.8％、図3dおよび補足図17および18）。したがって、DNAシトシンに作用するTadAを含むこれらのCBE（TADC）をCBE-Tと名付けます（図1d）。

Hek293T における CBE-T の強力な活性を観察した後、我々は、56 個の CBE-T の代表的なサブセットのシトシン塩基編集が 6 つのゲノム部位で以前に公開された ABE-P48R-UGI15 エディターと比較してどのような結果をもたらすかを評価することに興味を持ちました。私たちのエディターにアクセスするために必要な、バリアントごとの高度なアミノ酸置換（図1eおよび補足図16）。実際、CBE-Tは、C・GからT・Aへの編集効率、相対的なシトシンからアデニン塩基への編集産物の純度、および基質耐性においてABE-P48R-UGIを大幅に上回っていることがわかりました（補足図19）。 ABE-P48R-UGIと比較して、CBE-TはABE-P48R-UGIエディターの制限であるTCモチーフに制限されていなかったため、ここで報告されたCBE-Tはより普遍的に適用できると想定しています（補足図19）。。

CBE-T に存在する TADC が直交 Cas 酵素と互換性があるかどうかを判断するために、化膿連鎖球菌 D10A Cas9 ニッカーゼを黄色ブドウ球菌 Cas9 ニッカーゼ (SaCas9、PAM) に置き換えて、CBE-T の代表的なサブセットの塩基編集活性をスクリーニングしました。 :NGGRRT)、哺乳類細胞の ABE エディターと互換性があることが以前に示されています 13,20。実際、TADCはモジュラー酵素であり、SaCas9と互換性がありますが、テストした6つのゲノム部位全体で、BE4-SaCas9バリアントと同様に、適度なC·G-to-T·A編集効率のみを引き出すことが観察されました（補足図20）。

CABE-TおよびCBE-Tをより深く特徴付けるために、CABE-TおよびCBE-Tエディターの代表的なサブセットをコードするgRNAおよびin vitro転写（IVT）mRNAを化学合成し、それらを飽和および亜飽和用量の両方でHEK293T細胞にトランスフェクトしました。エディターをコードする mRNA (図 4a、b)。テストした CABE-T2 および T3 では、C・G から T・A への編集の最大値が平均 1.53 倍および 1.03 倍増加し、A・T から G への最大値が平均 2.18 倍および 1.67 倍向上したことが観察されました。 ·それぞれSPACEおよびA&C-BEmaxに対するC編集（補足図21）。テストしたすべてのサイトにわたって、BE4 と比較した特徴付けられた CBE-T の最大編集結果に有意差は見られず (P = 0.30、両側ウィルコクソン-マン-ホイットニー U 検定)、親編集者と比較した編集結果との顕著な差異が観察されました。安倍8.20。テストしたすべてのサイトで、当社の CBE-T は、ABE8.20 と比較して、編集全体で C・G から T・A への編集が平均 262 倍増加し、A・T から G・C への編集が一致して 13 倍減少しました。ウィンドウ（図4a〜cおよび補足図2および3）。

a、b、飽和時の合成 gRNA を介した 8 つの標的ゲノム遺伝子座にわたる、コア CBE-T バリアントをコードする mRNA とコントロールをトランスフェクトした HEK293T 細胞における C·G から T·A および A·T から G·C への最大変換 (500 ng) mRNA）（a）および亜飽和条件（62.5 ngの構築mRNA + 437.5 ngの非翻訳キャリアmRNA）（b）。 c、各標的部位位置（PAM = 位置21〜23）におけるCBE-T1バリアントとABE8.20の間のC・GからT・A（左）およびA・TからG・C（右）編集率の変化率8 つのゲノム部位にわたってテストされました (部位 1 ～ 8; 補足表 3)。 d、X軸で指定された各ターゲットウィンドウ位置でのC・GからT・Aへの変換の中央値。位置番号は位置21〜23として指定されたPAMとして定義されます。カラーマップの値は、飽和条件での mRNA トランスフェクションから決定されました。値と誤差は、異なる日に実行された n = 4 (飽和条件) または 3 (準飽和条件) の独立した生物学的複製の平均と標準偏差を反映しています。

ソースデータ

CABE-T および CBE-T が C-to-U 脱アミノ化メカニズムを介して進行することを確認するために、in vitro エンドポイント脱アミノ化アッセイを使用して、dsDNA に作用する gRNA プログラムされたリボ核タンパク質 (RNP) 複合体としてエディターのサブセットを評価しました。基板。このアッセイでは、CABE-T および CBE-T は、オンターゲット部位で 24 時間後に平均約 30% の C-to-U 基質脱アミノ化をもたらしました。これに対し、BE4 では約 58% であり、A-to は検出されませんでした。 -CBE-T の脱アミノ化を評価しました (拡張データ図 5a)。 C から U への基板の脱アミノ化に加えて、CABE-T は最大 35% の目標通りの A から I への脱アミノ化も実現しました。まとめると、これらのデータは、当社の CABE および TadA 変異体を利用した CBE の C-to-U 脱アミノ化活性に対する直交生化学的裏付けを提供します。別の実験では、dsDNA 基質上の CBE-T1.14 RNP の C-to-U 見かけの脱アミノ化速度定数 (kapp、速度とも呼ばれる) は 0.014 ± 0.006 min-1 と測定され、速度よりもはるかに遅かった。 dsDNA 上の ABE8.20 RNP の A-to-I 脱アミノ化 (0.17 ± 0.06 min-1; 拡張データ図 5b)、一方、非標的鎖のニッキング率はほぼ同一のままでした (拡張データ図 5b および補足データ図 5b)。 .22および23）。

CBE-TおよびBE4は、インビトロでの脱アミノ化速度が遅いにもかかわらず、5日間にわたって行われた細胞トランスフェクションにおいて、標的部位の同等の総脱アミノ化を引き起こした（図4a、b）。我々は、十分な時間が与えられれば、CBE-TによるC・GからT・Aへの編集またはCからUへの脱アミノ化の総量は、速度論的により速いBE4に匹敵するレベルに達するだろうと仮説を立てた。この観察と一致して、インビトロでの脱アミノ化時間を24時間に延長すると、CBE-TおよびBE4による同等の総C-to-U脱アミノ化がもたらされました（拡張データ図5a）。

次に、mRNAの亜飽和レベルで哺乳動物細胞トランスフェクションを実施することにより、送達されたmRNAの用量がシトシン塩基編集の結果にどのように影響するかを評価しました（補足図24）。これらの条件下では、CBE-T は飽和条件と比較して 55% ～ 70% の最大編集効率を維持し、サイトごとに APOBEC ベースの CBE と比較して同等以上のパフォーマンスを発揮しました。 CBE-T の代表的な編集者である CBE-T1.14、CBE-T1.46、および CBE-T1.52 は、8 つのゲノム部位にわたって平均最大 C・G 対 T・A 比率 66% を達成しました。これに対し、C・G の平均は 59% でした。 BE4によって達成されるT・Aに対する平均約35％のC・G、YE1によって達成されるT・A（図4bおよび補足図25）。また、CBE-Tが同様のレベルのインデル形成とCから非Tへの編集を引き起こすこともわかりました（補足図26および拡張データ図6a）。シチジンデアミナーゼを利用するCBEと比較して同等の生成物の純度およびインデルの結果は、ゲノムのウラシル病変修復のメカニズムによるものと考えられ、これは病変がどのように作成されたかに依存しません。

ABEと同様に、CABE-TとCBE-TはBE4と比較して編集ウィンドウが狭く、塩基編集がプロトスペーサーの位置3〜8にほぼ制限されていることを示します（図4cおよび補足図27）。さらに、APOBECベースのCBEと比較して、CBE-Tは、エディタの狭くなったターゲット可能なウィンドウに存在するCの数が平均して少ないため、生成するバイスタンダー突然変異が少ないことが観察されています（図4dおよび補足図27）。治療用途では、疾患の標的を考慮する場合、この塩基編集精度の向上が魅力的な特徴であることに注目します。関連して、基質としてのdsDNAに対するAPOBECの低いが検出可能な耐性により、BE4はプロトスペーサーに近位のdsDNAに作用することが特徴付けられていますが、CBE-TではこのdsDNA編集活性は観察されません（拡張データ図6b）。

CBE-T および CABE-T の gRNA 依存性 DNA オフターゲット編集を特徴付けるために、Cas9 および塩基エディターを使用して gRNA オフターゲットプロファイルが以前に特徴付けられているいくつかの gRNA を細胞に mRNA トランスフェクションを実行しました。、21。 CBE-TおよびCABE-Tは、調べたすべての部位でBE4およびBE4-PpAPOBECと比較してgRNA依存性のオフターゲット塩基編集頻度が低く、Tに対する最大C・Gが3.06倍および3.53倍減少していることがわかりました。それぞれA編集、および緩和されたオフターゲットエディターYE1およびBE4-PpAPOBEC-H122Aのレベルと同様のレベル（拡張データ図7および補足図28および29）。

CABE-T および CBE-T によって引き起こされるガイド非依存性の塩基編集と BE4 (C to T 編集の場合) または ABE8.20 (A to G 編集の場合) の比率を評価するために、クローン的に全ゲノムシーケンス (WGS) を実行しました。増殖した細胞を塩基エディターをコードするmRNAで処理し、前述のようにC・GからT・AまたはA・TからG・Cへの相対変異率を定量しました13（補足図30）。 CABE-TとCBE-Tの両方が、未処理サンプルと比較してゲノム全体のC・GからT・A SNVに有意な上昇を引き起こさないことを発見しました。このパターンは、YE1およびBE4-ppAPOBEC-H122Aでも報告されていました（すべてP > 0.05; 片側マンホイットニー U 検定)。対照的に、BE4 は、C・G から T・A 編集に対して、対照に対して 3.8 倍の平均濃縮倍数を引き起こし (P = 7.770e−05; 片側マンホイットニー U 検定)、BE4-PpAPOBEC は平均の 1.5 倍を引き起こしました。 C・G の T・A に対する濃縮倍数 (P = 0.00147; 片側マンホイットニー U 検定) (図 5a)6,13。 CABE-T および CBE-T も、ゲノム A・T から G・C SNV の有意な上昇を引き起こさなかった（すべて P > 0.05; 片側マンホイットニー U 検定）（図 5b）およびゲノム全体の確率的脱アミノ化未処理の細胞と区別がつきませんでした。

a、CABE-T3.155、CABE-T2.19、CBE-T1.14、CBE-T1.46、およびCBE-T1.52で編集された細胞における他のすべての突然変異タイプと比較したCからTへの突然変異のオッズ比プロット、 BE4、YE1、BE4-PpAPO、および BE4-PpAPO-H122A を未処理のクローン増殖細胞と比較し、黒いバーはその処理グループのオッズ比中央値を表します（P = 0.8359、0.7473、0.9476、0.8089、0.9751、7.770 × 10−それぞれ、5、0.9859、0.00148、0.7473、片側マン・ホイットニー U 検定）。すべての n = 8 の生物学的に独立した単一細胞の増殖細胞集団が各条件について示されています。 b、CABE-T33.155、CABE-T2.19、CBE-T1.14、CBE-T1.46、およびCBE-T1.52で編集された細胞における他のすべての変異タイプと比較したAからG変異のオッズ比プロット、およびABE8.20を未処理のクローン増殖細胞と比較し、黒いバーはその処理グループのオッズ比中央値を表します（それぞれP = 0.1641、0.4796、0.5204、0.8607、0.5204および0.2527;片側マン・ホイットニーU検定）。すべての n = 8 の生物学的に独立した単一細胞の増殖細胞集団が各条件について示されています。 c、gRNAの非存在下で、ssDNAとしてBE4、ABE8.20およびCBE-T1.14に提示された同じ基質のAからIまたはCからUの脱アミノ化のインビトロ動態。単一の指数関数フィットにフィッティングすることによって得られた擬似一次の見かけの速度定数 (kapp) が報告されます (平均 ± 標準偏差、n = 3 の独立した反復)。ゲルソースデータを参照してください。

ソースデータ

ssDNA 脱アミノ化の速度論的な違いを明らかにするために、ssDNA 基質上のガイド RNA を欠く塩基エディターの単一ターンオーバー、擬一次の見かけの脱アミノ化速度定数 (kapp) を in vitro で測定しました。 BE4 による C から U への脱アミノ化速度は 0.78 ± 0.02 min−1 であり、ABE8.20 によって引き起こされる A から I への脱アミノ化速度よりも約 11 倍高いことが測定されました (kapp = 0.071 ± 0.005 分− 1）同じssDNA基質の場合（図5cおよび補足図22）。 ssDNA の脱アミノ化速度のこの違いは、APOBEC ベースの CBE がゲノムの一本鎖領域を確率的に脱アミノ化できるという以前の観察とここで報告された観察をさらに裏付けています。我々は、CBE-T1.14が0.060±0.006min-1のkappでCからUへの脱アミノ化を触媒し、この速度はABE8.20によるAからIへの脱アミノ化について測定された速度と区別できないことを発見した（図5cおよび補足図）。 22) 同じ ssDNA 基板上。注目すべきことに、触媒残基はABE8.20とCBE-Tの間で変化しないままである(図2c、3aおよび拡張データ図1d、2、3c)。

CBE-T は、天然に存在するシチジンデアミナーゼを利用する CBE と比較して特性が改善されているため、遺伝子復帰およびサイレンシングにおける治療用途として大きな可能性を持っています。初代細胞における CBE-T の編集可能性を評価するために、我々はまず、長寿命初代ヒト肝細胞共培養系 23 において、高コレステロール血症 22 の治療に関連する標的である PCSK9 の発現を抑制する CBE-T の能力を評価しました。 PCSK9 遺伝子のノックダウンまたはノックアウトにより、血中の低密度リポタンパク質 (LDL) コレステロールのレベルが低下し、その後心臓病のリスクが低下します 24,25。実際、PCSK9 のスプライス部位ターゲティングによる有望な結果は、ABE8.8 を in vivo で使用して達成されています 26。同様に、ヒト初代肝細胞の PCSK9 遺伝子を標的とする合成ガイドを用いた CBE-T1.46 の mRNA トランスフェクションにより、導入された 2 つの PCSK9 標的部位において BE4 と同等以上の C・G から T・A への塩基編集効率が達成されることがわかりました。停止コドンQ555X、またはエクソン4でのプレmRNAスプライシングを破壊する（E4スプライス；図6a）。 ELISAによるPCSK9タンパク質レベルの評価は、試験した両方の標的部位でBE4と同等以上のレベルでCBE-T1.46によるPCSK9のノックダウンを示した(図6b)。一致して、CBE-T1.46で処理したサンプルでは両方の部位で総LDL受容体（LDLR）の増加が観察され（P<0.05、<0.01）、CBE-Tが治療に関連した表現型効果を生み出す可能性があることが実証されました（図1）。 6c)。

a、PCSK9遺伝子内の3つの部位でCBE-T1.46およびBE4をコードするmRNAをトランスフェクトした初代ヒト肝細胞の遺伝子編集結果（左、P = 0.2882（NS）;右、P = 0.0017（二重アスタリスク））。プロトスペーサー内の位置編集が示されました。ｂ、ＥＬＩＳＡによる、９日目（収集時点）と０日目（トランスフェクション時点）の間のＰＣＳＫ９分泌の相対変化の評価。標的となるPCSK9部位はx軸に示されている。 P 値は次のとおりです。Q555X 対未処理、P = 0.001001 (二重アスタリスク)。 E4 スプライスと未処理、P = 0.001295 (二重アスタリスク)。 c、ELISAによって評価した9日目と0日目の間の上清中に存在するLDL-Rの相対変化。 P 値は次のとおりです: Q555X 対未処理、P = 0.001116 (二重アスタリスク)、E4 スプライス対未処理、P = .009481 (二重アスタリスク)。 d、CBE-Tを使用した初代ヒトT細胞におけるsgRNAスクリーニングからの遺伝子編集効率。 X 軸ラベルは、sgRNA 内の標的遺伝子と標的塩基を示します。 e、f、多重編集された初代ヒトT細胞の各塩基エディターまたはコントロールによって達成されたC・GからT・Aへの変換率（e）および表面タンパク質損失（f）。一次肝細胞データは、n = 3 (「なし」/未処理サンプル) または 4 (BE4 および CBE-T1.46 サンプル) の独立した生物学的複製から生成されました。 T 細胞データは、n = 2 人の独立したドナーから生成されました。該当する場合、統計的有意性は対応のない両側 t 検定によって計算されました: NS、P ≥ 0.05。 *P < 0.05; **P < 0.01。

ソースデータ

次に、治療用 T 細胞工学への CBE-T の応用を評価しました。 TCRαβ発現T細胞に由来する自己T細胞療法は、一部のがんの治療に有効ですが、これらの細胞療法を患者ごとに製造すると、製品の一貫性がなくなり、製品のコストが高くなり、患者の治療に大幅な遅れが生じる可能性があります。遺伝子編集を使用して、多くの患者の治療のために単一のドナーから生成される、普遍的に適合する T 細胞療法を作成できます 27。普遍的に適合する T 細胞療法には、移植片対宿主病 (GvHD) の可能性を減らすために T 細胞受容体の発現を排除するための多重遺伝子サイレンシングと、同種異系 T 細胞の宿主拒絶反応を軽減または排除するための戦略の編集が必要です 28。 CBE-TがT細胞編集に使用できるかどうかを判断するために、CBE-TをコードするmRNAと、T細胞受容体の成分であるB2MまたはCIITAをコードする遺伝子を標的とするgRNAをT細胞にエレクトロポレーションしたところ、CBE-Tが同等または唯一の収量をもたらすことがわかりました。 BE4 コントロールと比較して編集効率がわずかに低くなります (図 6d)。多重化されたCBE-T編集は、単一編集と比較して同等の編集効率を実証し、対応するレベルのタンパク質ノックダウンをもたらし（図6e、fおよび補足図31）、治療のためのCBE-Tプラットフォームの可能性を示しています細胞工学。

ここでは、TadA の変異体を使用して、アデニン脱アミノ化の保持 (CABE-T) または喪失 (CBE-T) を伴うシトシンの脱アミノ化を触媒する 2 つの塩基エディターファミリー、CABE-T および CBE-T の開発について説明します。

計 10 回の指向性進化ラウンドと追加ラウンドの構造誘導設計の過程で、TadA は成熟し、最も多く操作された CBE-T に 29 を超える置換が含まれるようになりました (図 3c)。 X線結晶構造解析を通じて、置換の蓄積が活性部位空洞の形状にどのような影響を及ぼし、基質としてのシトシンの収容とその後のC-to-U脱アミノ化への特異性の変化に寄与する可能性があるかを示します。ここで開発された構造は、TadA のアミノ酸置換が細胞内で観察される遺伝子編集の結果にどのように影響するかを明らかにします。

ここで報告する CABE-T および CBE-T は、以前に報告された CBE と比較して、ガイド非依存性 DNA オフターゲットの結果が高度に軽減され、バイスタンダー編集が少なく、ガイド依存性の DNA オフターゲットが少ない精密塩基エディターです。 CBE-T コンストラクトで使用される TadA バリアントによる ssDNA の脱アミノ化。 TadA ベースの CBE-T および CABE-T は高いオンターゲット編集活性を保持し、単一および多重アプリケーションの両方で高い遺伝子編集効率を実現します。

最後に、当社の CBE-T は初代肝細胞や初代 T 細胞などの治療に関連する細胞タイプで活性であり、BE4 で達成できるものと同等またはそれ以上の編集結果が得られることを示します。我々は、CBE-TがPCSK9遺伝子座の標的部位を編集して分泌PCSK9タンパク質のレベルを低下させる能力と、同種異系CAR-T細胞の生成に関連するT細胞標的での高レベルの多重編集を達成する能力を実証する。

要約すると、高効率のシトシン塩基編集に使用するための TadA の開発は、治療ツールとしての CBE の開発における大きな進歩を意味します。 CABE-T および CBE-T は、ABE と合わせて、研究室で開発され高度に設計された TadA デアミナーゼを使用することにより、生細胞内にすべての DNA 遷移変異を個別または同時にプログラム可能に導入することを可能にし、その結果、シトシン塩基の潜在的な治療応用を拡張します。編集。

USER 酵素 (New England Biolabs、NEB、M5505L)、Phusion U DNA ポリメラーゼグリーンマルチプレックス PCR マスターミックス (Thermo Fisher Scientific、F564L)、Q5 Hot Start High の利用を含め、すべての分子生物学的方法とクローニング手順は前述のとおりに実行されました 13。 - Fidelity 2X Master Mix (NEB、M0494L)、Mach T1 コンピテントセル (Thermo Fisher Scientific、C8681201)、および ZymoPURE II Plasmid Midiprep キット (Zymo Research Corporation、D4201) は製造業者のプロトコールに従ってください。この研究で強調されている塩基編集者のアミノ酸配列は、補足配列 3 ～ 31 にあります。ゲノム部位を標的とするために使用される sgRNA の配列は、補足表 3 にあります。この研究で使用される代表的な CABE-T および CBE-T は、Addgene に寄託されています。

指向性進化ラウンド 1 および 2 の合成ライブラリーは、以下の仕様で Ranomics から入手しました: 進化ラウンド 1 TadA*8.20 ライブラリー - TadA*8.20 (ABE8.20 から) 配列の各アミノ酸位置は、20 個のアミノ酸すべてで表されます。ライブラリメンバー (約 1,000 万人のメンバー) あたり 1 ～ 3 回の置換の頻度で置換。このライブラリーはすべての停止配列を除外し、アミノ酸あたり 1 つのコドンのみを使用しました。この合成ライブラリーは、参考文献で以前に報告されているように、テンプレートとして TadA*8.19 (参考文献 13) を使用したエラープローン PCR で生成されたランダム化ライブラリーと結合されました。 12. 合成ライブラリーの第 2 ラウンドの進化 - TADAC1.02 配列の各アミノ酸位置は、ライブラリーメンバー (約 1,000 万メンバー) あたり 2 ～ 3 個の置換の頻度で、全 20 個のアミノ酸置換によって表されます。これらのライブラリーは、USER クローニングを通じて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を標的とする gRNA とともに死滅 Cas9 (dCas9 D10A および H840A) を含む細菌発現プラスミドにクローン化されました。

TadA8.19 および TadA8.20 ライブラリー (指向進化ラウンド 1) および TADAC1.02 ライブラリー (指向進化ラウンド 2) の指向進化を、参考文献に以前に記載されているように実行しました。 TadA*-dCas9-UGI エディター構造を含む細菌プラスミドに含まれるさまざまな TadA* デアミナーゼ変異体のライブラリーを、致死量の抗生物質による治療に耐えるためにクロラムフェニコール耐性遺伝子の編集を元に戻すことに挑戦しました。指向性進化の最初のラウンドでは、進化ライブラリーはエラーを起こしやすい ABE8.19m TadA* ライブラリーと合成 ABE8.20m TadA* ライブラリーの組み合わせであり、各アミノ酸位置は頻度 1 の 20 個すべての置換で表されます。 – ライブラリメンバーごとに 3 回の交代。抗生物質の課題を克服するには、2 回の C から T への復帰 (プロリン復帰と活性部位 His 復帰) が必要でした。進化の 2 ラウンド目では、CABE-T1.2 の合成ライブラリーが使用されました。これは、ABE8.20 TadA* ライブラリーとしての仕様で生成されましたが、ライブラリー・メンバーごとに 2 ～ 3 個の置換が含まれています。抗生物質の挑戦を克服するには、同じ 2 回の C から T への復帰と 2 回の A から G への STOP コドン復帰が必要でした。

HEK293T 細胞 (ATCC、CRL-3216) を、標準プロトコルに従って、10% (vol/vol) ウシ胎児血清 (Gibco、10437) を添加した DMEM + GlutaMAX (Gibco、10569) 中で 37 °C、5% CO2 で培養しました。 ATCC からのものであり、前述したとおりです。13

すべてのトランスフェクションでは、HEK293T 細胞をトランスフェクションの 16 ～ 22 時間前に、BioCoat ポリ-D-リジンでコーティングされた 48 ウェルプレート (Corning、356509) にウェルあたり 3.0 × 105 細胞の密度で播種しました。プラスミドのトランスフェクションは、前述のように、Lipofectamine 2000 (Invitrogen、11668-019) を使用して実行しました。13 mRNA のトランスフェクションは、メーカーのプロトコールに従って、Lipofectamine MessengerMAX を使用して、次の仕様で実行されました: 500 ng (飽和条件の場合) または 62.5 ng (亜飽和条件の場合)編集者または対照をコードするｍＲＮＡの（条件）および１００ｎｇの合成ｇＲＮＡを、総量１２．５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ血清低減培地（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５）中で混合した。次いで、１２．５μｌの１：１２．５（Ｌｉｐｏ：ＯｐｔｉＭＥＭ）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ混合物をｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ溶液に添加し、全内容物を周囲温度で１５分間放置した。亜飽和条件での mRNA トランスフェクションの場合、等量のトランスフェクト物質を維持するために 437.5 ng のキャリア mRNA も追加しました。次いで、２５μｌの混合物全体を使用して、予め播種されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を処理した。この研究で使用した sgRNA の配列は補足表 3 に指定されています。mRNA トランスフェクション用の合成 gRNA には、前述のように 5 '/3' 末端修飾があります。13

4日間のインキュベーション後、メーカーのプロトコールに従って100μlのQuick Extract DNA抽出バッファー(Lucigen、QE09050)を使用して、HEK293T細胞からのgDNAを細胞から回収した。同種異系 T 細胞の場合、トランスフェクションの 5 ～ 6 日後に 1 × 105 個の細胞に対して 50 μl の Quick Extract DNA 抽出バッファーを使用しました。哺乳動物細胞サンプルからのゲノム DNA サンプルは、イルミナの TruSeq HT システムと互換性のあるアダプター配列 (アダプター読み取り 1 配列、AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA; アダプター読み取り 2、配列 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT) を含む部位特異的ゲノム DNA 増幅用のプライマーを使用して増幅されました。これらのプライマーの配列を補足表 4 に示します。具体的には、Phusion U Green Multiplex Master Mix (Thermo Fisher Scientific、F564L) および各 0.5 μM のフォワードおよびリバースプライマーを含む PCR 反応混合物に、2 μl の gDNA を添加しました。次に、Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix を使用してこれらのアンプリコンをバーコード化し、最初のラウンドの PCR からのアンプリコン 2 μl を、フォワードおよびリバースバーコードプライマーのそれぞれの固有の組み合わせ 0.5 μM を含むマスターミックスに添加しました。サーモサイクリング条件は次のとおりです: 95 °C × 2 分の初期変性。 95 °C × 15 秒のサイクル変性。 62 °C × 20 秒のアニーリング。 72 °C × 20 秒の伸長。最初のアンプリコン生成では 30 サイクル、バーコーディングでは 10 サイクルの繰り返し。バーコード付きアンプリコンを精製し、ゲル電気泳動によってサイズを選択し、Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen、28706×4) を使用してゲル抽出し、得られた DNA 濃度を NanoDrop 1000 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) で評価しました。

すべての標的アンプリコン NGS データは、以下のツール/ソフトウェアの使用を含む、前述の方法を使用して分析されました: Trimmomatic (v0.39)、bowtie2 (v2.35)、samtools (v1.9)、および bam-readcounts (v0.8) ).13

BWA mem2 (bwa-mem2-2.2.1) を使用して、FASTQ ファイルをヒトゲノム (Gencode GRCh38v31 プライマリアセンブリ) にアライメントしました。アライメントは座標によってソートされ、必要に応じてマージされ、デフォルト設定で Picard (v2.21.7) を使用して重複がマークされました。次に、GATK (v4.1.4.1) を使用して基本品質スコアの再調整を実行し、バリアント呼び出し用の LoFreq (v2.1.5) への入力用の BAM ファイルを作成しました。バルクサンプル 1 を正常サンプルとして使用し、クローン増殖させた各細胞を別個の腫瘍サンプルとして実行して、各細胞に特異的な体細胞変異を同定しました。 LoFreq は、バリアントサイトでの少なくとも 10 回のカバレッジを必要とする「–min-cov 10」フラグを指定して実行され、体細胞バリアントは somatic_final_minus-dbsnp.snvs 出力ファイルから分析され、偽陽性である可能性が高い一般的なバリアントが削除されました。

オッズ比プロットでは、C-to-T および A-to-G の両方の脱アミノ化について、処理細胞と未処理細胞の両方と比較するための参照点として、未処理のクローン増殖細胞からの単一の代表細胞が必要です。この細胞は、A から G への変異の割合および C-T への変異の割合によって未処理の細胞を順序付けし、両方のメトリクスの中央値に最も近い 1 つの細胞を選択することによって選択されました。 N1 は、C-to-T 変異の場合は 5/8 位、A-to-G 変異の場合は 3/8 位にあり、CABE-T 処理と CBE-T 処理の両方にわたる参照細胞の最良の候補となっています。

TadA * 8.20 タンパク質を、N 末端に His および SUMO タグを持つ pET51b+ ベクターにクローニングし、LB 培地中の大腸菌 BL21 Star (DE3) 細胞 (NEB、C2527I) で発現させました。細胞培養物を 240 rpm で振盪しながら 37 °C で増殖させ、OD600 が 0.6 に達したときに 0.5 mM IPTG によってタンパク質発現を誘導しました。細胞培養物を振盪しながら18℃で一晩インキュベートした。回収した細胞を溶解バッファー (25 mM Bis-Tris、500 mM NaCl、1 mM TCEP、10% (vol/vol) グリセロール、pH 6.0、および 1 mM PMSF) 中で高圧ホモジナイザーで溶解し、細胞溶解物を超遠心分離により清澄化されます。清澄化したライセートを、4 °C で 1 時間バッチ結合することにより、Ni-NTA アガロース樹脂にロードしました。樹脂を重力流カラム上で２０ｍＭのイミダゾールを含む溶解緩衝液で洗浄し、続いて５０／１００／２５０ｍＭのイミダゾールを補充した溶解緩衝液で溶出した。溶出したサンプルを、２５ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ、３００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴＣＥＰ、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールおよびｐＨ６．０中で一晩透析しながら、Ｕｌｐ１とともにインキュベートした。透析サンプルを Ni-NTA 樹脂にロードして、切断されていないタンパク質と Ulp1 を除去しました。逆 Ni-NTA からのフロースルーを 5 ml ヘパリン HP カラム (Cytiva) にロードし、0 ～ 2 M NaCl 勾配を使用して溶出しました。 TadA * 8.20タンパク質を含む画分を、25 mM Bis-Tris、300 mM NaCl、1 mM TCEP、10% (vol/vol) グリセロール、pH 7.0中のSuperdex75 10/300でのサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。 TADAC-1.14タンパク質をpET51b+ベクター内でN末端Hisタグとともに発現させ、Ulp1タグ切断および逆Ni-NTAステップを省略したことを除き、上記のように精製した。 TADAC-1.17 および TADAC-1.19 を、N 末端 His タグおよび SUMO タグを備えた pD881 ベクター (ATUM) にクローニングし、大腸菌 BL21 細胞 (NEB) で発現させました。タンパク質発現は、OD600 0.6 で 0.2% (wt/vol) ラムノースによって誘導され、その後 37 °C で 4 時間インキュベートされました。精製は上記のように行った。これらのデアミナーゼ変異体は、X 線結晶構造解析に使用されました。生化学的研究に使用されるすべての CBE-T ベースエディタータンパク質は、わずかに変更を加えて上記のように発現および精製されました。

アデニン類似体 2-デオキシ-8-アザンブラリン (d8Az)、5'-G(1)C(2)T(3)C(4)G(5)G(6) を含む ssDNA を用いた TadA*8.20 の結晶化条件)C(7)T(8)d8Az(9)C(10)G(11)G(12)A(13)-3' は、Mosquito ロボット (SPT LabTech) を使用して 20 °C で特定され、最適化されました。ドロップは、タンパク質と ssDNA 溶液 (25 mM Bis-Tris 中の 0.15 mM TadA*8.20、300 mM NaCl、1 mM TCEP、10% (vol/vol) グリセロール、pH 7、pH 7、および 0.22 mM ssDNA を d8Az に加えたもの) 1 μl を混合することによって調製しました。）および1μlのリザーバー溶液（27〜29％（vol/vol）PEG 3,350、0.22〜0.26M酢酸アンモニウム、0.1M Tris pH 8.5）を加え、70μlのリザーバー溶液に対して平衡化した。結晶を凍結保護剤溶液（１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、２９％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＰＥＧ３，３５０、０．２６Ｍ酢酸アンモニウム、０．１ＭトリスｐＨ８．５）に移し、液体窒素中で瞬間冷却した。

アデニン類似体 2-デオキシ-8-アザンブラリン (d8Az)、5'-G(1)C(2)T(3)C(4)G(5)G(6) を含む ssDNA を含む TADAC-1.17 の結晶化条件)C(7)T(8)d8Az(9)C(10)G(11)G(12)A(13)-3' は、Mosquito ロボット (SPT LabTech) を使用して 20 °C で特定され、最適化されました。ドロップは、タンパク質と ssDNA 溶液 (25 mM Bis-Tris 中の 0.15 mM TADAC-1.17、300 mM NaCl、1 mM TCEP、10% (vol/vol) グリセロール、pH 7、および 0.22 mM ssDNA を d8Az に加えたもの) 1 μl を混合することによって調製しました。 )および1μlのリザーバー溶液(4～8% (vol/vol) PEG 3,350、8～10% Tacsimate pH 6)を加え、200μlのリザーバー溶液に対して平衡化した。結晶を凍結保護剤溶液（１２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＰＥＧ３，３５０、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）タクシメートｐＨ６、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール）に移し、液体窒素中で瞬間冷却した。

ssDNA を含まない TADAC-1.14 (TADAC-1.14-holo) の結晶化条件を特定し、Mosquito ロボット (SPT LabTech) を使用して 20 °C で最適化しました。ドロップは、1 μl のタンパク質溶液 (25 mM Bis-Tris、450 mM NaCl、1 mM TCEP、10% (vol/vol) グリセロール、pH 7 中の 0.18 mM TADAC-1.14) と 1 μl のリザーバー溶液 ( 1.8 ～ 2.0 M 硫酸アンモニウム、0.1 M HEPES pH 7.5) を使用し、200 μl のリザーバー溶液に対して平衡化しました。結晶を凍結保護剤溶液（１．８Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２０％（体積／体積）グリセロール）に移し、液体窒素中で瞬間冷却した。

ssDNA を含まない TADAC-1.19 (TADAC-1.19-holo) の結晶化条件は、Mosquito ロボット (SPT LabTech) を使用して 20 °C で特定および最適化されました。ドロップは、1 μl のタンパク質溶液 (25 mM Bis-Tris、300 mM NaCl、1 mM TCEP、10% (vol/vol) グリセロール、pH 7 中の 0.3 mM TADAC-1.19) と 1 μl のリザーバー溶液 ( 6 ～ 12% (vol/vol) PEG 3,350、0.3 ～ 0.5 M 三塩基性クエン酸アンモニウム、pH 7.0)、200 μl のリザーバー溶液に対して平衡化しました。結晶を凍結保護剤溶液（１６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＰＥＧ３，３５０、０．６Ｍ三塩基性クエン酸アンモニウムｐＨ７．０、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール）に移し、液体窒素中で瞬間冷却した。

データ収集は、国立シンクロトロン光源 II のフロンティアマイクロフォーカシング高分子結晶学 (FMX) ビームライン、欧州シンクロトロン放射線施設の ID30B ビームライン、または ALBA シンクロトロンの BL13-XALOC ビームライン、または EMBL ハンブルクの P13 ビームラインで実行されました。 PETRA III ストレージリング (DESY) にて。回折データは XDS29 を使用して処理され、AIMLESS30 を使用してスケーリングされました。 ssDNA の有無にかかわらず、TadA*8.20、TADAC-1.17、TADAC-1.14、および TADAC-1.19 の結晶構造は、Phaser31 で実装された分子置換技術によって決定されました。 TadA*8.20 構造の場合、大腸菌 TadA 構造の座標 (Protein Data Bank (PDB) コード: 1Z3A)32 を使用して初期相を取得しました。 TADAC-1.17、TADAC-1.14、および TADAC-1.19 構造の場合、TadA*8.20 (この研究) の座標を使用して初期位相を取得しました。分子置換の後、モデルのバイアスを除去するために、phenix.refine33 でシミュレートされたアニーリングが実行されました。モデルは、Coot34 を使用してモデル構築と水分子の追加を反復することによって洗練されました。 phenix.refine での構造の精密化には、非結晶学的対称拘束、位置および B 因子の精密化、および TLS (平行移動、リブレーション、ねじ) が使用されました (TADAC-1.17 および TADAC-1.14 を除く)。 TadA*8.20 および TADAC-1.17 の結晶は、Britton 解析 (phenix.xtriage) により、それぞれ 0.375 および 0.246 の双晶率でメロヘドラル双晶化しており、精密化には双晶則 -h,-k,l が使用されました。データ収集と精密化統計は補足表 2 にまとめられています。167 残基と 13 ヌクレオチドの構造で視覚化された残基とヌクレオチドは補足表 5 にリストされています。図は PyMol ソフトウェア (Schrodinger、2010) で作成されました。グラフィックスシステム、バージョン 2.4.1。)。

sgRNA (mG*mA*mA*CACAAAGCAUAGACUGCGUUUUAGAGCUAGAAAAUAGC)

aaguuaaaaauaaggcuucccguuaucaacuugaaaaaaaguggccccgagucgggugcu*mu*mu*mu; 修飾: m、2'-O-メチル、および *、ホスホロチオエート結合) は、Agilent Technologies および Integrated DNA Technologies (IDT) で合成されました。基質 DNA は IDT で合成されました。脱アミノ化を受けた DNA 鎖 (TTCGGTGGCTCCGTCCGTGAACACAAAGCATAGACTGCCGGCGTTTTGGTTGCTCTTCG) は 5' ATTO-647 蛍光色素で標識され、D10A ニッカーゼによるニッキングを受けた相補的な DNA 鎖 (CGAAGAGCAACCAAAACGCCGGCAGTCTATGCTTTGTGTTCACGGACGGAGCCACCGAA) 5' 6-FAM フルオロフォアで標識されています。ガイド RNA に依存しない脱アミノ化には、ATTO-647 標識一本鎖 DNA をそのまま使用しました。ガイド RNA 依存性の脱アミノ化では、2 倍過剰の鎖にニッキング (1:2 nmol) を加えて 2 つの鎖をアニーリングすることによって dsDNA 基質を調製しました。二本鎖DNAを7.5% Native-PAGE (29:1、アクリルアミド:ビスアクリルアミド; Sigma)によって精製した。 dsDNAを含むアクリルアミドバンドを切り出し、破砕し、破砕浸漬緩衝液(400mM NaClおよび25mM EDTA)中で一晩回転させてdsDNAを溶出した。溶出した dsDNA は、1 倍量の 100% 2-プロパノールを加えた後、-20 °C で 2 時間沈殿させ、続いて 4 °C、20,000 g で 30 分間遠心分離しました。 DNA ペレットを 1 容量の 70% vol/vol エタノールで洗浄し、20,000g、4 ℃で 30 分間遠心分離しました。ペレットを室温で３０分間風乾し、水に再懸濁した。

RNP 複合体は、sgRNA と適切なベースエディタータンパク質を「RNP アセンブリおよび反応バッファー」(20 mM HEPES-KOH pH 7.4、100 mM KCl、5 mM MgCl2、5% vol/%) 中で 1.5:1 のモル比で混合することによって形成されました。容積グリセロール、２ｍＭＴＣＥＰ）を加え、室温で２０分間インキュベートする。

インビトロでのガイド RNA 依存性 dsDNA 脱アミノ化の単一ターンオーバー動態の場合、RNP の最終濃度 1 μM になるまで、最終濃度 10 nM dsDNA 基質 (RNP アセンブリおよび反応バッファー中で 100 nM に調製) を添加して脱アミノ化を開始しました。反応物を 37 °C でインキュベートし、5 μl のアリコートを指定の時間間隔で抜き取りました。反応を50μlのクエンチングバッファー（50 mM Tris-Cl、pH 8.5、400 mM NaCl、25 mM EDTA、0.1% SDS、1 μlの熱不安定性プロテイナーゼK（New England Biolabs、NEB P8111S）および1 μlの15 mg）でクエンチしました。 ml-1 共沈剤 Glycoblue (Thermo Fisher Scientific、A9515))、37 °C で 15 分間。熱不安定性プロテイナーゼ K は 75 °C で 15 分間不活化されました。

次いで、クエンチした反応時点を、上記のように２－プロパノールで沈殿させた。 ABEによって触媒された脱アミノ化アデニン（イノシン）を検出するために、参考文献で以前に説明されているように、沈殿した時点をエンドヌクレアーゼVで処理しました。 20、35。 CBE によって触媒された脱アミノ化シチジン (デオキシウリジン) を検出するために、製造者のガイドラインに従って、沈殿した時点を USER II (NEB、M5508L) で処理しました。サンプルを等量のホルムアミドゲルローディングバッファー (95% ホルムアミド、25 mM EDTA、0.025% SDS、および 0.025% ブロモフェノールブルー) と混合し、98 °C で 5 分間加熱し、変性 7.5% 尿素 PAGE (19 :1、アクリルアミド:ビスアクリルアミド; National Diagnostics)。反応は、ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad) を使用して、FAM でゲルを連続的にスキャンし、続いて Alexa-647 設定でスキャンすることによってモニタリングしました。切断されていない DNA および切断された DNA の強度を ImageJ 1.53 K を使用して定量化しました。データを Prism 9 (GraphPad Prism、v9.4.0) の単一指数関数的減衰に当てはめて、見かけの脱アミノ化率 (kapp) を計算しました。アッセイしたすべての塩基エディターにわたって一定である、塩基エディターの D10A-ニッカーゼによる基質 DNA のニッキングを 6-FAM 蛍光団で検出し、均一に活性な組換えタンパク質を確保するためのコントロールとして使用しました。

in vitro でのガイド RNA 非依存性 ssDNA 脱アミノ化の単一ターンオーバー動態については、反応を上記と同様に設定しましたが、次の変更を加えました: 塩基エディターは sgRNA でプログラムされず、ATTO-647 標識 ssDNA 鎖とともにインキュベートされました。

ABE 8.20、BE4、CABE-T2.17、CABE-T3.155、CBE-T1.14、および CBE-T1.52 による脱アミノ化を比較するための in vitro エンドポイント脱アミノ化アッセイでは、脱アミノ化反応を 1-上記のμM BE RNPおよび10nM dsDNA基質。時点の代わりに、反応全体を24時間後にクエンチし、上記のように沈殿させた。沈殿した反応物を水に再懸濁し、4 つの等しい部分に分割しました:未処理、記載のエンドヌクレアーゼ V で処理、記載の USER II で処理、およびヒトアルキルアデニングリコシラーゼ (hAAG; NEB 0313S)、続いて AP エンドヌクレアーゼ 1 (APE1; NEB 0313S) で処理しました。 NEB M0282L) 製造元の指示に従ってください。 hAAG と APE1 の組み合わせが使用されたのは、G:U (シトシン脱アミノ化の生成物) が EndoV の基質であるという実験的観察があり、これは NEB (https://www.neb.com/tools-and-resources) によって確認されました。 /selection-charts/dna-repair-enzymes-on-damage-and-non-standard-bases)。したがって、EndoV は、A-to-I および C-to-U の相対的な脱アミノ活性に関して ABE、CABE、および CBE を比較する場合には使用できません。ｈＡＡＧはより特異的であり、同じ実験条件下でＡからＩに対して検出可能な切断生成物のみを生成し、ＣからＵへの脱アミノに対しては生成しなかったため、このような比較に使用された。これらの処理後、サンプルを尿素 PAGE で分離し、データを上記のように定量化しました。

この研究で使用した mRNA は、参考文献に以前に記載されたプロトコルに従って、エディターとコントロールをコードする発現プラスミドの in vitro 転写を通じて生成されました。 13.

HEK293T 細胞を、リポフェクタミンメッセンジャーMAX (Thermo Fisher Scientific、LMRNA001) を介して、コントロール (Cas9、SPACE など) またはエディターをコードする mRNA と、β-2-ミクログロブリン (B2M) の領域を標的とする合成 gRNA (Axolabs からの特注品) をトランスフェクトしました。）。この合成ガイドのシーケンスは次のとおりです (Axolabs 固有の構文): ascsusCACGCUGGAUAGCCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGGUGCusususU

この部位での ABE、CBE、または Cas9 によるターゲティングが成功した場合の B2M の破壊は内部的に検証されています。トランスフェクションの 3 日後、細胞を TrypLE Express で解離し、遠心分離により細胞染色バッファー (Biolegend、420201) で洗浄し、1:100 の PE 結合抗ヒト B2M 抗体 (Biolegend、316306) を含む細胞染色バッファーに再懸濁しました。暗所の氷上で３０分間インキュベートした後、遠心分離により細胞を細胞染色緩衝液で３回洗浄し、標準的な５ｍｌのＦＡＣＳチューブに濾した。

PE陰性としてゲートされた単一細胞を、DMEM + 20% FBS + 100単位/mlのペニシリン/ストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific、15140122)を含む96ウェルプレートに選別した。未処理の対照については、単一細胞を生細胞のみで選別しました。代表的なゲーティング戦略を補足図30に示します。12日間の培養後、Agencourt DNAdvancedキット（Beckman-Coulter、A48705）を製造業者のプロトコルに従って使用して、gDNAを細胞から回収しました。各クローンの編集が成功したことの確認は、標的部位を含む B2M アンプリコンの標的アンプリコン配列決定によって達成されました。配列が確認された gDNA は、ライブラリーの調製と WGS のために Novogene に提出されました。

ヒト T 細胞は、CD4 および CD8 MicroBeads (Miltenyi、130045101 および 130045201) を使用したポジティブ選択によって白血球除去製品 (Leukopaks、HemaCare) から単離されました。 T 細胞は、Cryostor CS10 (Stemcell Technologies、1001061) 1 ml あたり 25 ～ 50 × 106 細胞で凍結されました。編集実験のために、T 細胞を 37 °C のウォーターバスで解凍し、(Stemcell Technologies、10981) 5% CTS Immune Cell SR、Glutamax、10 mM HEPES、 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (Thermo Fisher Scientific、15140122)。翌日、細胞 1 ml あたり 1 × 106 細胞の ImmunoCult Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator (Stemcell Technologies、10970) 25 μl と 300 IU ml-1 の IL-2 を使用して、T 細胞を活性化しました ( CellGenix、1420050）。新鮮な IL-2 を 2 ～ 3 日ごとに T 細胞に添加しました。 T 細胞は 37 °C、5% CO2 で培養されました。

活性化の 72 時間後に T 細胞をトランスフェクトしました。細胞を、サプリメント 1 (Lonza、V4SP-3960) を含む P3 Primary Cell Nucleofector Solution に再懸濁しました。 P3 96 ウェル Nucleocuvette キット (Lonza、V4SP-3960) を使用して、1 × 106 T 細胞を 1 μg の合成 sgRNA (IDT) と 2 μg のエディター mRNA で総量 20 μl で編集しました。使用される 3 つの sgRNA は次のとおりです。B2M Exon 2 (B2M Ex.2)、pmSTOP C6、CD247 pomSTOP C7 および PD-1 Ex.1 SA C7 は補足表 3 に指定されています。T 細胞は 4D-Nucleofector システムでエレクトロポレーションされました。 (Lonza、AAF-1003B および AAF-1003S) プログラム DH-102 を使用。すべての実験は 2 人の独立した T 細胞ドナーを用いて行われました。 NGS 分析では、各時点で条件ごとに 1 × 105 個の T 細胞をペレット化し、上清を除去し、ペレットを 50 ml の QuickExtract DNA Extraction バッファー (Lucigen、QE09050) に再懸濁し、標的アンプリコン配列決定のために PCR プレートに移しました。

タンパク質ノックアウトは、編集後 5 ～ 6 日後にフローサイトメトリーによって評価されました。 T細胞を、TCRα/β（Biolegend、306718）、β2M（Biolegend、316304）およびPD-1（Biolegend、367422）に対する蛍光標識抗体を用いて、標準PBSで1:33希釈して染色しました。フローサイトメトリーによる PD-1 分析では、T 細胞を染色前に Cell Activation Cocktail (brefeldin A なし) (Biolegend) で一晩処理しました。イベントは MACSQuant Analyzer 16 (Miltenyi) を使用して収集されました。データはFlowJoソフトウェア（v10.8.1）を使用して分析されました。

極低温凍結した初代ヒト肝細胞 (BioIVT) を解凍し、BioCoat コラーゲン I 24 ウェルプレート (Corning、354408) に 1 ウェルあたり 3.5 × 105 細胞の密度でプレーティングし、以下に従って Torpedo Antibiotic Mix (BioIVT) を補充した CP 培地で維持しました。 BioIVT が提供するプロトコルを使用します。 PHH 単培養物を一晩確立したら、長寿命 PHH 培養物の生成には、確立された PHH 単培養物に 3T3-J2 マウス線維芽細胞 (Kerafast、EF3003) を 1 ウェルあたり 2.0 × 104 細胞で追加共培養する必要がありました。 PHH 共培養は、研究期間中 48 時間ごとに培地を交換して維持されました。

PHH 共培養物は、3T3-J2 マウス線維芽細胞との共培養生成の 48 時間後にトランスフェクトされました。 mRNA のトランスフェクションは、メーカーのプロトコールに従って、Lipofectami MessengerMax (Thermo Fisher Scientific、LMRNA003) を使用して、以下の最適化された仕様で実行されました: エディターをコードする 1 μg (飽和条件の場合) の mRNA と 333 ng の合成 gRNA (Synthego) 30μlのOptiMEM血清低減培地(Gibco、31985)に混合した。 1:15 (リポフェクタミン:OptiMEM) 混合物 30 μl を mRNA/gRNA 溶液に添加し、得られた最終混合物を周囲温度で 15 分間放置しました。 60 μl 溶液全体を、共培養した初代ヒト肝細胞のウェルを処理するために使用しました。各研究条件は 3 回実行され、使用されるトランスフェクション量はそれに応じてスケールアップされました。トランスフェクションの 9 日後、PHH 共培養物を 10 mM Tris-HCl pH8.0 (Thermo Fisher Scientific、15568025)、0.05% SDS (Thermo Fisher Scientific、15553027)、および 500 μg プロテイナーゼ K (Thermo Fisher) の溶液で溶解しました。 Scientific、EO0491) をウェルあたり合計 200 μl で添加します。溶解後、ライセートを 85 °C で 15 分間処理してプロテイナーゼ K を不活化しました。この研究で使用した sgRNA の配列を補足表 3 に示します。

PCSK9 タンパク質ノックダウンの定量化は、Human PCSK9 SimpleStep ELISA キット (Abcam、ab209884) を使用して、48 時間ごとに収集した上清中の分泌 PCSK9 濃度を測定することによって評価しました。アッセイ緩衝液を使用して上清を10倍に希釈し、製造業者のプロトコールに従ってアッセイプロトコールを実行した。 LDL-R 定量は、Human LDL-R SimpleStep ELISA キット (Abcam、ab209884) を使用して、48 時間ごとに収集した上清中の分泌 LDL-R タンパク質を測定することによって評価しました。どちらの SimpleStep ELISA キットも、アフィニティータグで標識された捕捉抗体とレポーター結合検出抗体を採用しています。捕捉抗体と検出抗体はサンプル分析物に結合し、その後分析ウェルをコーティングする抗タグ抗体に固定化されます。どちらの比色 ELISA アッセイも 450 nm の吸光度で読み取られます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべての実験の基礎となる次世代配列データは、提出プロジェクト PRJNA869750 の下で NCBI Sequence Read Archive (SRA) に保管されています。原子座標と構造因子は、8E2P、8E2Q、8E2R、8E2S のエントリとして PDB に登録されています。図のソースデータが利用可能です。 1、3 ～ 6、拡張データ図 5 ～ 7、および補足図 2 ～ 4、6、15、17 ～ 21、22 ～ 29 (ゲル画像ソースファイルを含む)。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

データ分析に使用されるすべてのソフトウェアツールは公的に入手可能であり、参考文献で前述した方法で使用されました。 13.

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自動化サポートに対する M. Humes と B. Gantzer (Beam Tx) に感謝します。 NGS と計算のサポートについては、J. Decker と David Born (Beam Tx) に感謝します。我々は、FACS の専門知識と WGS 実験で使用した細胞の選別について R. Manoukian と L. Hardy (Beam Tx) に感謝し、感謝します。タンパク質の結晶化にご協力いただいた A. Arvind (Beam Tx) に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Dieter K. Lam、Patricia R. Feliciano。

Beam Therapeutics、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

ディーター・K・ラム、パトリシア・R・フェリシアーノ、アメナ・アリフ、タンギス・ボーヌード、トーマス・P・フェルナンデス、ジェイソン・M・ゲールケ、フィル・グレイソン、キン・D・リー、マヌエル・A・オルテガ、コートニー・ソーヤー、ノア・D・シュヴェーゲル、レイラ・ペラーロ、ローレン・ヤング、スンジュ・リー、ジュゼッペ・シアラメッラ、ニコール・M・ガデリ

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DKL、PRF、AA、MAO は指向進化、構造、生化学、遺伝子編集実験を実施し、原稿を執筆しました。 CS、NS、KDL が実験を行いました。 TPF、JMG、LPは初代細胞実験を実施し、データを分析し、原稿を執筆しました。 TB、PG、LY は配列データを分析し、統計分析を実施しました。 S.-JL は構造生物学、生化学、タンパク質工学の研究を指揮し、原稿を執筆しました。 GC が原稿を編集しました。 NMG が研究を企画、指揮し、原稿を執筆しました。

ニコール・M・ガウデリへの通信。

すべての著者は、この研究が実施された時点では Beam Therapeutics の従業員であり、同社の株主でもあります。 Beam Therapeutics はこの研究に関して特許出願を行っています。

Nature Biotechnology は、この研究の査読に貢献してくれた Sangsu Bae と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a, 上のパネルは、TadA によって触媒されるアデノシンの加水分解的脱アミノ化を示しています。下のパネルは、アデニン類似体である 2'-デオキシ-8-アザンブラリン (d8Az) の水和を示し、亜鉛と配位して活性部位に捕捉される遷移状態類似体を形成します。 b、ssDNA (黄色) に結合した TadA*8.20 機能性ホモ二量体の全体構造 (A 鎖は濃い緑色、B 鎖は薄緑色)。 c、TadA*8.20モノマーの全体構造。モノマー (薄緑色) には 5 つの β ストランド (β1 ～ β5) と 6 つの α ヘリックス (α1 ～ α6) が含まれており、中央の 5 本鎖の β シートが α ヘリックスに囲まれた単一ドメインに折りたたまれます。亜鉛イオンは灰色の球として示されています。 d、ssDNA-d8Az遷移状態類似体が結合したTadA*8.20活性部位。触媒亜鉛 (灰色) イオンは、ヒスチジン残基 (H57)、2 つのシステイン残基 (C87 および C90)、および d8Az 遷移状態類似体 (黄色) に配位します。水素結合は灰色の破線で示されています。 e. ssDNA (黄色) に結合した TadA*8.20 二量体 (暗緑色と薄緑色) の表面。ssDNA がタンパク質二量体界面に位置する活性部位の深い空洞に結合し、置換基を含む両方の単量体の残基と相互作用していることを示しています。野生型 TadA と比較した I76Y、L84F、D108N、R152P、E155V、および I156F。タンパク質表面の置換はオレンジ色 (W23R、H36L、R51L、I76Y、および A106V)、C 末端はピンク色 (S146C、D147R、R152P、Q154R、E155V、I156F、および K157N) で示されています。シアンの活性部位 (P48A、V82S、L84F、および D108N)。 f、ssDNA (黄色) と TadA*8.20 活性部位残基間の相互作用。鎖 A および B の残基は、それぞれ濃い緑色と薄い緑色で示されています。タンパク質表面、C 末端、および活性部位の置換は、それぞれオレンジ色 (鎖 A)、ピンク色 (鎖 B)、およびシアン (鎖 B) で示されています。亜鉛イオンは灰色の球で示されています。水素結合は黒い破線で示されています。立体図を補足図7に示します。

ソースデータ

a、ssDNA (黄色) が結合した TADAC-1.17 機能性ホモ二量体の全体構造 (鎖 A は濃青色、鎖 B はスレートブルー)。 TadA * 8.20 と比較した置換 (T17A、A48G、S82T、および A142E) をシアン色の球で示します。 b、ssDNA（黄色）との複合体中のTADAC-1.17モノマー（スレートブルー）の全体構造。このモノマーには 5 つの β ストランド (β1 ～ β5) と 6 つの α ヘリックス (α1 ～ α6) が含まれており、中央の 5 本鎖の β シートが α ヘリックスに囲まれた単一ドメインに折りたたまれます。 C および 5' は、それぞれ ssDNA の C 末端および 5' 末端を表します。 c、ssDNA-d8Az遷移状態類似体が結合したTADAC-1.17活性部位。触媒亜鉛イオン (灰色の球) は、H57、C87、C90、および d8Az 遷移状態類似体 (黄色) を配位します。 T82 側鎖 (シアン) は触媒作用のある E59 側鎖 (3.9 Å; シアンの破線) の近くにあり、E59 にプロトンを供与したり E59 からプロトンを受け取ったりすることによって脱アミノ化に役割を果たしている可能性があります。残基 A17 (シアン) は、タンパク質表面の α1 ヘリックス内にあります。残基 G48 (シアン) は、基質結合ポケットの α2 ヘリックス内にあります。 d8Az 遷移状態類似体とタンパク質残基間の H 結合は灰色の破線で示されています。 d, α5ヘリックスに位置するE142の側鎖は、α6ヘリックスに位置するR153側鎖にH結合し(灰色の破線)、C末端α6ヘリックスを安定化してF156側を配置するのに役立ちます。 dT(8) のピリミジン塩基と相互作用する鎖 (シアンの破線)。

a, TADAC-1.14 機能性ホモ二量体の全体構造 (鎖 A は濃い黄色、鎖 B は薄い黄色)。 TadA * 8.20 と比較した置換 (I49K、Y76I、および G112H) をマゼンタの球で示します。残基 H2 は無秩序であり、構造内で視覚化されません。亜鉛イオンは灰色の球として示されています。破線は、β4 と β5 (R107 から V130) の間の部分的に無秩序な (A109 から A114) ループを表します。 b、TADAC-1.14 モノマーの全体構造。鎖 A (濃い黄色) と B (薄い黄色) の間の重ね合わせは、β4 と β5 の間のループ (R107 から V130) の 2 つの異なる立体配座を示しています。 c、亜鉛イオン（灰色の球）に水（赤色の球）が結合したTADAC-1.14活性部位。残基 H57、C87、および C90 は亜鉛イオンと配位します。水の分子 (赤い球) は触媒残基 E59 に水素結合します (灰色の点線)。 TadA 反応の最初のステップでは、この水が基質に添加されて遷移状態種が形成されます (拡張データ図 1a)。 d – f、基質を含まないTADAC-1.14（暗黄色）とssDNA結合TadA * 8.20（暗緑色および黄色）構造間の構造比較。置換 G112H (マゼンタ) を含む β4 と β5 の間の TADAC-1.14 ループは、TadA*8.20 とは異なる立体構造を持ち、残基 A109 と塩基 dT(8) の間で立体衝突を起こすことによって ssDNA (黄色) の結合に影響を与える可能性があります。 (1.8-Å)、これはターゲット塩基 d8Az(9) に隣接しています (d)。置換 Y76I (マゼンタ) は、塩基 dG(12) との相互作用 (黒い破線) を保存することにより、ssDNA 結合に影響を及ぼさない可能性があります (e)。置換 I49K は、K49 側鎖を dC(10) 骨格 (約 4.5 Å; 黒破線) の近くに配置し、タンパク質 - DNA 複合体の安定化に寄与している可能性があります (e)。 TADAC-1.14 (暗色および薄黄色) の表面は、β4 と β5 の間のループの新規立体構造により、TadA*8.20 (暗色および薄緑色) と比較して活性部位空洞の形状が変化することを示しています (f)。

a、TADAC-1.19 機能性ホモ二量体の全体構造 (濃いピンク色と薄いピンク色)。 TadA*8.20と比較したE27GおよびI49N置換はオレンジ色の球で示されている。亜鉛イオンは灰色の球として示されています。 b、TADAC-1.19 モノマーの全体構造。 CはC末端を表します。 c、亜鉛イオンに結合した水（赤い球）を含むTADAC-1.19活性部位。 H57、C87、C90 は亜鉛イオンに配位します。水分子は触媒残基 E59 に水素結合します (破線)。 d – h、TADAC-1.19 と TadA*8.20 構造間の構造比較。（ d ）基質を含まないTADAC-1.19（ピンク）とssDNA結合TadA * 8.20（緑、黄色）モノマーの重ね合わせ。高い構造類似性を示します（すべてのCα原子について約0.9ÅのRMSD）。主な構造の違いは、α1 ヘリックス、α1 と β1 の間のループ、および C 末端の α5 および α6 ヘリックスにあります。（ e ）TadA * 8.20には、A48、I49、およびG50の主鎖へのE27側鎖H結合（黒い破線）があり、E27G置換によりこれらの相互作用が除去されます。これらの重要な接触を補償するために、TADAC1.19 は、TadA*8.20 で以前 E27 が占めていたのと同様の位置に E25 を配置し、A48、I49、および G50 と同じ H 結合 (オレンジ色の点線) を形成します。 E25 置換により α1 ヘリックスが短縮され、E27G 置換を含む α1 と β1 の間のループ (オレンジ) が延長され、TadA*8.20 (d、f、g) と比較して異なる立体構造に適応します。これにより、α5-ヘリックスが部分的にアンフォールディングされ、このループ構造との立体衝突が防止され、α6-ヘリックスが完全にアンフォールディングされます（dおよびg）。これらの構造変化はTADAC-T1.19活性部位空洞の形状を変化させ(h)、活性部位の基質結合に影響を与えます(図2b)。 TADAC-T1.19 ループ (オレンジ) に存在する R26 は、TadA*8.20-ssDNA の標的塩基 d8Az(9) および dG(11) に隣接する dC(10) と密接に接触します (シアンの点線)。 g)。 I49N 置換により、N49 側鎖は ssDNA 骨格から遠く離れた位置に配置されます (dG(11) から約 9 Å; シアンの破線) (f)。これは、リジンのようなより長い正電荷側鎖を持つ残基が、ssDNA 骨格との追加の接触を生み出すことを示唆しています。 TADAC-T1.14 構造で観察される ssDNA (拡張データ図 3e)。

a、BE4、ABE8.20、CABE-T、および CBE-T による相対的な A-to-I (hAAG + APE1) および C-to-U (USERII) の脱アミノ化を検出するための In vitro 24 時間エンドポイント脱アミノ化アッセイ同じガイドでプログラムされ、同じ dsDNA 基質に作用します。エンドヌクレアーゼ V、Endo V。ヒトアルキルアデニン DNA グリコシラーゼ、hAAG。脱プリン性/非ピリミジン性エンドヌクレアーゼ 1、APE1。エラーバーは、3 つの独立した反復の平均 (プロット) からの標準偏差を表します。データは未処理のサンプルに対して正規化されました。 Endo V は、A-to-I および C-to-U の両方の脱アミノ化を検出します。 b、左、BE RNPによる同じdsDNA基質のAからIまたはCからUの脱アミノ化のシングルターンオーバー速度。右、左に示したものと同じ実験における BE RNP によるニッキングのシングルターンオーバー率。単一指数関数にフィッティングすることによって得られた擬似一次 kapp 速度定数が報告されます (平均 ± 標準偏差、n = 3 の独立した反復)。

ソースデータ

a、コア CBE-T および BE4 用に編集されたようにマッピングされたシーケンシングリードの生成物分布。指定された標的シトシン (赤で強調表示) が変異しています。値は、飽和条件での mRNA による HEK293T のトランスフェクションから決定されました。値とエラーバーは、異なる日に実行された n = 3 の独立した生物学的複製における平均値と SD を反映しています。 b、プロトスペーサーターゲットウィンドウの外側および5'の最大C・GからT・A変換のカラーマップ。いずれのエディターでも C-to-T 編集が 0.8% 以上検出されたターゲットサイトの位置が含まれます。値は、飽和条件でエディターまたはコントロールをコードする mRNA を使用した HEK293T のトランスフェクションから決定され、n = 4 の独立した生物学的複製が異なる日に実行されました。

ソースデータ

mRNAコードエディター（またはコントロール）プラスをトランスフェクトしたHEK293T細胞における、ゲノム部位での最大オンターゲットC・GからT・A変換%および対応するオフターゲット部位での最大C・GからT・A変換のカラーマップ飽和条件での合成 sgRNA。中央値は、異なる日に実行された n = 3 の独立した生物学的複製から得られました。

ソースデータ

補足図。 1 ～ 31、補足表 1 ～ 5、補足配列 1 ～ 31、および補足参考文献。

補足図の統計ソースデータ。 2～4、6、15、17～21、24～29。

補足図22のゲル画像ソースデータ。

補足図23のゲル画像ソースデータ。

Excel のタブに数字またはサブ数字の番号が付いている統計ソースデータ。

示されているすべてのゲルベースのデータのトリミングされていないゲル（問題の主要図および拡張図に常にリンクされている補足図22および23のものを含む）。

Extended DataのChemDraw構造ファイル図1

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転載と許可

ラム、DK、フェリシアーノ、PR、アリフ、A. 他 TadA バリアントから生成された改良されたシトシン塩基エディター。 Nat Biotechnol 41、686–697 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41587-022-01611-9

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受信日: 2022 年 8 月 16 日

受理日: 2022 年 11 月 9 日

公開日: 2023 年 1 月 9 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-022-01611-9

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