微生物に対して異なる好みを持つ 2 つのマメ科植物の脂肪酸アミド加水分解酵素アイソフォーム

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7486 (2023) この記事を引用

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脂肪酸アミド加水分解酵素 (FAAH) は、真核生物で広く保存されているアミダーゼであり、おそらく N-アシルエタノールアミン脂質メディエーターを不活化することで最もよく知られています。 しかし、FAAH 酵素は広範囲のアシルアミド基質を加水分解します。 複数の被子植物種からの FAAH の分析により、基質結合ポケット内の重要な保存残基が異なる 2 つの保存された系統発生グループが明らかになりました。 FAAH1と呼ばれる植物FAAHの基礎グループは、シロイヌナズナの構造および機能レベルで研究されているが、FAAH2メンバーについては何も知られていない。 今回我々は、計算的アプローチと生化学的アプローチを組み合わせて、MtFAAH1 および MtFAAH2a と呼ばれるマメ科 Medicago truncatula の 2 つの FAAH アイソフォームの構造的および酵素的特性を比較しました。 相同性モデリング、分子ドッキング、分子動力学シミュレーション実験から予測された基質結合ポケットの構造的および物理化学的特性の違いは、これら 2 つの FAAH アイソフォームがアミドヒドロラーゼ活性プロファイルに違いを示すことを示唆しました。 実際、精製された組換えMtFAAHの反応速度論的研究は、MtFAAH1が長鎖アクリルアミドをより効率的に利用し、MtFAAH2aが短鎖および芳香族アクリルアミドをより効率的に加水分解するという、相互にアシルアミド基質を好むことを示した。 系統発生的に異なる 2 つの植物 FAAH の酵素挙動に関するこの最初の報告は、マメ科植物および他の植物種における FAAH アイソフォームに関するさらなる研究の基礎を提供するでしょう。

脂肪酸アミド加水分解酵素 (FAAH) は、親油性 N-アシルエタノールアミン (NAE) をエタノールアミンと遊離脂肪酸に加水分解する保存されたアミダーゼです 1、2、3、4。 例えば; ラット、マウス、およびヒトの FAAH は、内因性アナンダミド (NAE20:4) をアラキドン酸とエタノールアミンに加水分解します 5,6。 哺乳類では、このプロセスは、痛みの知覚から食事の調節に至るまで、さまざまな神経学的および生理学的プロセスに関連しています7,8。 別の例では、植物のコケである Physcomitrella patens に由来する組換え FAAH も、NAE20:4 を対応する生成物に加水分解することができ、これはコケ種の成長と発達に関連していると考えられます9。 他の場所では、C. elegans は長寿の調節をサポートするために NAE20:4 を代謝する FAAH 酵素を保有していることが示されました 10。 これらおよび他の多くの報告は、さまざまな生物学的プロセスにおける NAE 制御のための複数の種にわたって広く保存されている FAAH 機構を実証しています。

モデル植物であるシロイヌナズナの in vitro および in vivo 研究では、A. thaliana FAAH (AtFAAH) が飽和 (NAE12:0 など)、単飽和 (NAE18:1 など) などの内因性 NAE のアミド結合を切断できることが示されました。多価不飽和（例えば NAE18:3）種、および 9-LOX 由来の NAE オキシリピン（9-ヒドロキシ リノレオイル エタノールアミド; NAE-9-HOD）1,11,12,13。 FAAH による NAE 含有量の調節は、さまざまな生物学的プロセスと関連しているようです 14。 例えば、シロイヌナズナでは、AtFAAH を過剰発現する系統は、野生型植物と比較して、内因性 NAE の量が少なく、実生の成長 15、開花時期 16、自然免疫 17 において大きな差異を示しました。 対照的に、シロイヌナズナの faah ノックアウト株は内因性 NAE 含量が上昇しており、NAE (例 NAE12:0 または NAE18:2)15,18,19、アルカミド 20,21、N-アシルホモセリンラクトンの外部適用によって誘導される増殖阻害に対して過敏でした。 (AHL)22、または植物ホルモン ABA13。 別の報告では、AtFAAH を異所的に過剰発現させた高地ワタ (Gossypium hirsutum L.) の苗木は、NAE12:0 または NAE18:2 由来の水酸化物 (NAE-9-HOD) に対して非感受性を示し、したがってシロイヌナズナで見出される結果と似ていました 23。 これらの報告は、FAAH による N-アシルエタノールアミド含有量の制御が植物の多くの生理学的プロセスに影響を与える可能性があることを示唆しています。

N-アシル-ʟ-ホモセリンラクトン（AHL）またはN-アリール-ʟ-ホモセリンラクトン（アリール-HL）は、細胞間コミュニケーション（クオラムセンシング、QS）プロセス（バイオフィルムなど）で利用される細菌由来の脂質です。生産）または宿主との相互作用（例えば、共生細菌または病原性細菌の認識）24、25、26。 NAE とこれらの QS 分子（アミド結合したアシル尾部を持つ極性頭部基）間の構造的類似性により、植物 FAAH が AHL およびアリール HL を加水分解できるという仮説が立てられました 22。 さらなる実験により、組換えAtFAAHは、OdDHL（N-(3-オキソドデカノイル)-ʟ-ホモセリンラクトン）やOtDHL（N-(3-オキソテトラデカノイル)-ʟ-ホモセリンラクトン）などのアシル鎖の長いAHLを、より短い鎖のAHLよりもよく加水分解することが明らかになりました。 OHHL (N-(3-オキソヘキサノイル)-ε-ホモセリンラクトン)22 など、AtFAAH 活性が基質のアシル鎖の長さ/性質に影響される可能性があることを示しています。 同じ実験において、アリール-HL、p-クマリル-HLはAtFAAH22の基質としては不十分でした。 また、AHL はシロイヌナズナの実生において「二相」成長反応を引き起こすことが示されました。 彼らの実験では、AHLを与えられた野生型シロイヌナズナの実生は、低濃度（例えば0.1μM）または高濃度（例えば100μM）のAHLでそれぞれ増強または低下した成長表現型を示した22。 次に、シロイヌナズナのfaahノックアウトとの比較により、そのような感受性はFAAH依存的に調節できること、つまり成長シグナルの調節にはFAAHによるAHLの加水分解が必要であることが明らかになった22。

アルカミドは真菌または植物由来の脂肪酸アミドであり 21、27、28、FAAH 媒介加水分解に関連する NAE 様分子の別のグループを構成します 20。 野生型シロイヌナズナでは、アルカミド、アフィニン (N-イソブチル頭部基とアシル鎖) の外因性適用により、AHL の効果に似た「二相」効果が生じました (上記参照)。 実際、28 μM 未満の濃度でアフィニンを与えられたシロイヌナズナの野生型実生は、対照よりも長い一次根を持っていました 21。 逆に、28 μM を超える濃度のアフィニンは、根の発達を著しく阻害しました 21。 別の研究では、シロイヌナズナの FAAH 過剰発現体または faah ノックアウトにより、アルカミド感受性が FAAH 加水分解を介して調節されることが実証されました 20。 興味深いことに、アフィニンまたはさまざまなアシル鎖長およびアルキル頭部基の他の 12 個のアルカミドに対する in vitro AtFAAH 活性は、NAEs20 の AtFAAH 加水分解の活性と比較してはるかに劣っていました。 それにもかかわらず、これらの報告は、アルカミドの FAAH 加水分解と植物成長効果との関連性を裏付けています。

FAAH は、保存された Ser-Ser-Lys 触媒トライアドの存在を特徴としています 1,29,30。 アシル結合チャネル (ABC) の活性部位に到達した N-アシルアミドは、基質と酵素の間に共有結合中間体を形成します。 これは、基質のカルボニル基の炭素を攻撃する触媒セリン (求核剤) の活性化によって達成されます 31。 哺乳類と植物の FAAH は、基質結合に関して異なるメカニズムを持っているようです。 例えば、AtFAAH は、「スクイーズ アンド ロック」と呼ばれるプロセスにより、ヘリックス領域 (残基 531 ～ 537) の移動とその膜アクセス チャネル (MAC) の閉鎖につながる構造変化を受けると考えられています1。 対照的に、ラットのFAAHでは、リガンドと酵素の複合体は、その狭いMACを閉じて活性部位の基質を「捕捉」する「動的パドル」によって確保されている。 どちらの場合も、FAAH 触媒作用の後、エタノールアミンは細胞質アクセス チャネル (CAC) を介して細胞質ゾルに放出され、脂肪酸生成物は膜二重層の疎水性環境に放出されます 1,29。 植物と哺乳類の両方の FAAH の結晶構造が解明されたことにより、他の生物の FAAH の参照として使用できる重要な構造および機能成分についての洞察が得られました。

最近、多様な被子植物種の 88 個の FAAH アミノ酸配列の比較により、2 つの主要な系統グループ、FAAH1 と FAAH232 が明らかになりました。 A. thaliana や Camelina sativa などのアブラナ科の植物種は 1 つの FAAH アイソフォーム (FAAH1) のみを示しましたが、Amborella trichopoda (「被子植物の祖先種」) を含むすべての双子葉植物および単子葉植物の種は両方の FAAH グループを持ち、多くは 2 つ以上の FAAH グループを持っていました。メンバー1名32． たとえば、トマト (Solanum tuberosum) には 3 つの FAAH1 アイソフォームと 1 つの FAAH2 がありますが、イネ (Oryza sativa) には 1 つの FAAH1 と 2 つの FAAH2 アイソフォームがあります 32。 複数の配列アラインメントの分析により、FAAH1 および FAAH2 アイソフォームの基質結合ポケットに対応する領域の残基変化が示されました。 大豆 (Glycine max) FAAH の相同性モデリングにより、大豆 FAAH1 と FAAH232 の間のさらなる構造的および化学的差異が明らかになりました。 これらの違いは、FAAH1 酵素と FAAH2 酵素の基質選択性に影響を与えると仮説が立てられ、さらに、FAAH が親油性シグナル伝達脂質の拡張されたレパートリーを調節するために異なる FAAH 機構を進化させた可能性があることを示唆しています 32,33。 概念的にはこの概念はもっともらしいように見えますが、これまでのところ、FAAH2 グループの酵素に関連する生化学的情報が存在しないため、この仮説を裏付ける実験的証拠は不足しています。 今回我々は、コンピューターと生化学的アプローチを組み合わせて、マメ科植物 Medicago truncatula 由来の 2 つの FAAH、MtFAAH1 および MtFAAH2a を研究および特徴付けることで、この知識のギャップに対処し、これら 2 つのアイソフォームが相互の基質優先性を有するという証拠を提供します。

マメ科植物内の FAAH の多様性を調べるために、AtFAAH (FAAH1 酵素) を参照として使用して、選択した 10 種の FAAH アミノ酸配列を比較しました (図 1a; 補足表 S1)。 データは、これらのマメ科植物の FAAH が、FAAH1 および FAAH2 と呼ばれる 2 つの主要なグループにクラスター化していることを示しました (図 1a)。 各マメ科植物種で FAAH1 アイソフォームが 1 つだけ同定されました。 特に、FAAH2 はほとんどの種で 2 つのサブグループ、FAAH2a と FAAH2b を形成しました。 G. max と Vigna radiata を除いて、残りのマメ科植物 (M. truncatula を含む) は 2 つの FAAH2 アイソフォームを持っていました。 FAAH1の創設メンバーであるAtFAAHと比較して、MtFAAH1、MtFAAH2a、またはMtFAAH2bのアミノ酸配列類似性の割合は、それぞれ約66％、44％、44％でした（補足図S1;補足表S2）。

Medicago truncatula FAAH、すなわちMtFAAH1およびMtFAAH2aの配列および相同性モデルの分析。 (a) 10 種類の異なるマメ科植物の FAAH のアミノ酸配列の系統解析。 A. thaliana FAAH (AtFAAH) 配列も、FAAH1 コントロールとして分析に含めました。 アスタリスクは、この研究でさらに調査されたMtFAAH配列を示します。 (b) MtFAAH1 および MtFAAH2a の相同性モデル (上のパネル)。 膜アクセス チャネル (MAC) と膜結合キャップ (MBC) が構造内で標識されています。 視覚化の目的で、同じモデルの 90° ビューが含まれています (下のパネル)。 AtFAAH のアミダーゼ シグネチャー (AS) ドメイン (紫) を、(c) MtFAAH1 の AS (緑色) または (d) MtFAAH2a の AS (黄色) と重ね合わせました。 (c) と (d) の両方について、触媒三残基の拡大図が表示されます。

Medicago truncatula Gene Expression Atlas「MtExpress」34 における MtFAAH1、MtFAAH2a、および MtFAAH2b の転写発現プロファイルの検査により、MtFAAH1 または MtFAAH2a がさまざまな組織、温度条件、時点、非生物的ストレス (窒素飢餓など) および生物的ストレス（例えば、アーバスキュラー菌根菌であるリゾファガス・イレギュラーリスへの曝露）に対して、同じ条件では、MtFAAH2bの発現レベルははるかに低かった（補足図S2）。 これらのデータに基づいて、コンピューターと生化学的アプローチの両方によるさらなる分析のために、MtFAAH1 および MtFAAH2a を選択しました。

MtFAAH1およびMtFAAH2aの相同性モデルは、それらの構造的特徴を比較するためにAtFAAH（PBD：6DHV）の結晶構造に基づいて予測されました（図1b）。 MtFAAH1 および MtFAAH2a モデルの品質は、GMQE (グローバル モデル品質推定) スコア (MtFAAH1 で 0.90、MtFAAH2a で 0.80)、QMEANDisCo (Qmean コンセンサスベースの距離制約) スコア (MtFAAH1 で 0.88、MtFAAH2a で 0.79) によって裏付けられました。ラマチャンドランスコア（ラマチャンドランが有利、MtFAAH1については95.59％、MtFAAH2aについては94.31％）（補足図S3、S4;補足表S3、S4）。 両方のモデルは、アルファヘリックス、ベータシート、ターン、非構造化コイルの全体的な予測内容と構成が同様のホモ二量体（図1b）として示されています（補足図S5）。 MtFAAH1とMtFAAH2aは両方とも、N末端に保存された膜結合キャップ（MBC）と膜アクセスチャネル（MAC）を持ち（図1b、補足図S6）、これらはFAAHを膜に固定すると予測されています1。 AtFAAHの結晶構造と同様に、両方のMtFAAHのMBCは疎水性残基の蔓延によって特徴付けられます（補足図S6）。 予想通り、AtFAAHのアミダーゼシグネチャー（AS）ドメインは、他のFAAHファミリーメンバーと同様にSer-Ser-Lys触媒トライアドの存在を特徴とし、これらの残基はここMtFAAH1およびMtFAAH2aで保存されています（図1c、d）。 。 まとめると、これらのデータは、MtFAAH1 および MtFAAH2a の予測される膜結合および活性部位残基の保存を強調しています。

以前の報告では、ダイズFAAH1およびFAAH232の基質結合ポケット（SBP）の予測形状と特性を変えるいくつかの重要な残基の違いが強調されています。 このような所見が異なるマメ科植物種でも保存されていることを裏付けるために、我々は M. truncatula FAAH、MtFAAH1 および MtFAAH2a の SBP を分析しました。 データにより、特にサイトゾルアクセス（CAC）およびアシル結合（ABC）チャネル内で複数の残基の違いが明らかになりました（図2;補足表S5）。 MtFAAH1のCACにはいくつかの極性アミノ酸（例：Thr299、Glu337）がありますが、MtFAAH2aのCACのこれらの残基は非極性アミノ酸（例：Val306、Trp341）です（図2a〜e）。 さらに、MtFAAH1は、そのCAC内にそれほど嵩張らない残基であるGly334を配置しており、これにより、対応するFAAH2の空洞と比較して、より開いた空洞が提供されるようです（図2a〜e）。 逆に、MtFAAH2a には CAC 内に大きな芳香族残基 Trp341 があり、これによりより制限的な CAC が生じます（図 2a-e）。 MtFAAH1 の ABC は、Leu441、Phe475、Met531 などの非極性/疎水性残基によって特徴付けられますが、MtFAAH2a では、これらの残基は、より中性、極性、芳香族の環境を提供する 3 つのチロシン残基 (Tyr444、Tyr477、および Tyr533) に置き換えられています (図 1)。 2a–e)。 さらに、MtFAAH2a のチロシン残基により、より閉じた短い ABC が得られました（図 2a-e）。 対照的に、MtFAAH1の残基は、芳香族および疎水性の表面プロファイル（図2d、e）に示されているように、AtFAAH11のACBとより類似した、より開いたABCを生成しました。 特に、MtFAAH1またはMtFAAH2のSBPで見られる残基のいくつかは、複数のマメ科植物種のFAAH1またはFAAH2グループ間で保存されています（補足図S7）。 まとめると、これらのデータは、MtFAAH1 と MtFAAH2a がそれらの SBP に異なる構造的および物理化学的特性を持っていることを示唆しています。 したがって、これらの異なる SBP は異なるアシルアミド構造に対応する可能性があります。

MtFAAH1 と MtFAAH2a の基質結合ポケット (SBP) は、異なる構造的および物理化学的プロファイルを明らかにします。 (a) MtFAAH1 (シアン色の棒) または (b) MtFAAH2a (オレンジ色の棒) の SBP で異なると予測される残基が表示されます。 両方のMtFAAHのSBPを形成すると予測される残基の完全なリストは、補足表S3にあります。 (c) MtFAAH1 と MtFAAH2a のアミノ酸配列間の部分的なアラインメント。 シアンまたはオレンジのフォントで残基を指す矢印は、それぞれ、MtFAAH1 または MtFAAH2a の SBP 内の別個の残基を表します。 (d) (a)、(b)、および (c) で強調表示された残基の芳香族表面は、異なる芳香族プロファイルを明らかにします。 芳香族スケールは、芳香族側鎖を持つ残基の端 (青) から面 (オレンジ) への立体配座を表します。 (e) (a)、(b)、および (c) で強調表示された残基の疎水性表面プロファイル。 疎水性スケールの範囲は、最も高い疎水性領域 (茶色) の 3.00 または最も低い (青色) 領域の - 3.00 です。

MtFAAH1 と MtFAAH2a の SBP の違いが基質結合と調節をどのように変化させるかをテストするために、分子ドッキング実験を実施しました (図 3)。 ドッキング実験の前に、MtFAAH1 と MtFAAH2a の両方を幾何学的に安定化させるために、MtFAAH1 と MtFAAH2a のアポ型の分子動力学シミュレーション (MDS) を 100 ns 実行しました。 結果として得られる MD 軌道は、二乗平均二乗偏差 (RMSD) および二乗平均二乗変動 (RMSF) 計算によって研究されました。 どちらのMtFAAHも、MtFAAH1の場合は約1.5〜1.7Å、MtFAAH2aの場合は1.8〜2.2ÅのRMSD値で、シミュレーション全体を通じて安定しているように見えました（補足図S8）。 RMSF値は、MtFAAH1と比較した場合に高い変動が観察された残基366〜387で構成されるMtFAAH2aの配列領域を除いて、両方のMtFAAHで同様の変動プロファイルを示しました（補足図S8）。

MtFAAH1 または MtFAAH2a のサブユニット A と異なる N-アシルアミドとの分子ドッキング。 MtFAAH の 8 つの潜在的なリガンドの 2D 構造は、ChemDraw (Molecular Editor) ソフトウェアを使用して描画されました (a)。 8 つのリガンド候補の中から、ドッキング実験用に NAE18:2、NAE12:0、および p-クマリル-HL の 3 つを選択しました。 すべてのドッキング実験の前に、Apo MtFAAH1 および MtFAAH2a を分子動力学シミュレーション (MDS) (100 ns 間) に供しました。 MtFAAH1 または MtFAAH2a にドッキングされた NAE18:2 (b、c)、NAE12:0 (d、e)、または p-クマリル-HL (f、g) の拡大図と拡大図。 共有結合は、MtFAAH1 (Ser304) または MtFAAH2a (Ser311) の触媒残基の側鎖酸素と基質のカルボニル基の炭素の間のシアンの線として表されます。 水素結合は青色の線で表示され、疎水性 (ファンデルワールス) 相互作用は相互作用する原子間の灰色の破線で表示されます。 結合内に表示される数字は、接触点間の距離 (Å) を表します。 略語: 基質結合ポケット (SBP)。

ドッキング研究では、構造的に異なる 3 つのアシルアミド (図 3a)、NAE18:2、NAE12:0、または p-クマリル-HL を比較しました。 MD 安定化 MtFAAH1 または MtFAAH2a 相同性モデルは、これら 3 つのリガンドとドッキングされました (図 3b-g)。 ドッキングにより、Ser304 または Ser311 の側鎖酸素 (Oγ) と基質のカルボニル基の炭素との間の結合距離が 2.1 ～ 2.6 Å の範囲の共有結合の可能性が明らかになりました。 NAE（NAE18:2またはNAE12:0）の極性エタノールアミン頭部基は、MtFAAH1（図3b、d）とMtFAAH2a（図3c、e）の両方のSBP内の複数の水素結合によってサポートされていました。 これには、MtFAAH1 の Gly301、Gly254、Thr299、および Asp206 などの残基、および MtFAAH2a の Gly308 および Gly309 などの残基が含まれます。 p-クマリル-HLに結合したMtFAAHを検査すると、いくつかの興味深い類似点と相違点が明らかになりました。 MtFAAH1とMtFAAH2aは両方とも、p-クマリル-HLの頭部基との水素結合にグリシン残基（MtFAAH1の場合はGly301、MtFAAH2aの場合はGly308）を必要としました（図3f、g）。 しかし、p-クマリル-HLのホモセリンラクトン(HL)頭部基は、Glu213、Met345、およびVal306によって媒介されるさらなる水素結合により、MtFAAH2aのSBPにおいてはるかに多く支持されていた。さらに、MtFAAH1は、p-クマリルとの水素結合相互作用のためにThr299を位置決めしていた。 -HLヘッドグループであるのに対し、MtFAAH2aはHLヘッドとの疎水性相互作用のためにTrp341の芳香族側鎖とPro338のピロリジンループを持っていました（図3f、g）。 これらのデータは、触媒作用を達成するための触媒三残基の同様の組織化を示し、MtFAAH の活性部位における基質の異なる極性「頭部領域」を安定化するための類似かつ異なる相互作用を示唆しています。

NAEまたはp-クマリル-HLのアシル鎖とMtFAAHのSBPの残基間の相互作用の分析により、特定の類似点と相違点が明らかになりました。 NAE18:2のアシル鎖は、Leu441および一連の3つのスレオニン残基(Thr257、Thr258、Thr529)との疎水性相互作用によってMtFAAH1内で支持されている。 MtFAAH1におけるこれらの残基の幾何学的配置は、AtFAAH11について報告されたものと同様に、長いアシル鎖を収容するための柔軟な環境を提供すると思われます（図3b、補足図S9）。 MtFAAH2aにおけるNAE18:2の結合は、Thr264、Ile447、Ile540、および2つのチロシン残基Tyr533およびTyr444との予測された疎水性相互作用によって裏付けられました（図3c）。 MtFAAH1と比較して、MtFAAH2a結合ポケットの表面は、NAE18:2を収容するために異なる形状をしているようでした（図3c;補足図S9）。 NAE18:2のアシル鎖は、おそらくMtFAAH2aのより制限されたサイズのSBPに調整するために、MtFAAH2aでは構造的にさらに圧縮されている可能性があるようです（図3c;補足図S9）。 MtFAAH1またはMtFAAH2aにドッキングされた短いNAE（NAE12:0）のアシル鎖は、どちらの場合も、脂肪族アミノ酸イソロイシンとのファンデルワールス相互作用によってサポートされています（MtFAAH1の場合はIle444、MtFAAH2aの場合はIle540）（図3d、e）。 さらに、MtFAAH2aは、NAE12：0テールのC11およびC12の位置での相互作用のために芳香族残基チロシン（Tyr533）を配置していますが、MtFAAH1は、NAEのアシル鎖のC10での相互作用のためにLeu441を表示します（図3d、e）。 MtFAAH1とは異なり、MtFAAH2aは、NAE12:0をSBPに収容するためのより芳香性の表面を所有しているようです（図3d、e;補足図S9）。 最後に、MtFAAH1は、Thr257とアリール-HLの芳香族尾部との間の予測されたファンデルワールス相互作用によってp-クマリル-HLを収容します（図3f）。一方、MtFAAH2aは、類似の残基（Ile447）との相互作用に加えて、芳香族残基も配置しています。 、Tyr477、p-クマリル-HLのフェノールアシル部分との追加の水素結合およびπ-π相互作用用（図3g;補足図S9）。 これらのデータは、MtFAAH1 または MtFAAH2a が、異なる物理化学的特性を持つ残基を介して NAE またはアリール HL を収容できることを示唆しています。 実際、MtFAAH1 は一般に脂肪族側鎖を持つ疎水性残基を利用しているようですが、MtFAAH2a は一貫して芳香族側鎖を持つ中性残基に依存しています。

MtFAAH の基質の調節に潜在的に関与している可能性のある追加の残基とメカニズムをさらに詳しく分析するために、NAE18:2 または p-クマリル-HL とドッキングした MtFAAH1 または MtFAAH2a に対して 100 ns の間、分子動力学シミュレーション (MDS) を実行しました (図4、5;補足図S10、S11;補足表S6;補足ビデオ1〜12）。 MtFAAH1 および MtFAAH2a の MDS 軌跡により、NAE18:2 または p-クマリル-HL が、異なる予測される相互作用を通じて適応できることが明らかになりました。

NAE18:2 (a、c) または p-クマリル-HL (b、d) に結合した MtFAAH1 のサブユニット A の分子動力学シミュレーション (MDS)。 「0 ns」は平衡化された複合体 (オレンジ) に対応し、「10 ns」および「100 ns」は 10 (紫) および 100 ns (緑) で MDS 処理された複合体を表します。 重ね合わせた漫画とスティックとして表示されたヘリックス領域 (残基 530 ～ 536)、ドッキング実験から選択されたリガンド (球) と重ね合わせられた残基 (スティック) を含む基質結合ポケット (SBP)、および予測される α1 および α2 ヘリックスの拡大および拡大図は、漫画とスティック (a、b) が重なって表示されます。 ファンデルワールス結合（黄色の破線）内に表示された数字は、接触点間の距離（Å）を表します。 NAE18:2 (c) または p-クマリル-HL (d) に結合した MtFAAH1 の膜アクセス チャネル (MAC) の表面の拡大図。

NAE18:2 (a、c) または p-クマリル-HL (b、d) に結合した MtFAAH2a のサブユニット A の分子動力学シミュレーション (MDS)。 「0 ns」は平衡複合体 (黄色) に対応し、「10 ns」および「100 ns」は 10 (青色) および 100 ns (シアン) で MDS 処理された複合体を表します。 重ね合わせた漫画とスティックとして表示されたヘリックス領域 (残基 530 ～ 536)、リガンド (球) を含む基質結合ポケット (SBP) とドッキング実験から選択された重ね合わせられた残基 (スティック)、および予測される α1 および α2 ヘリックスの拡大および拡大図は、漫画とスティック (a、b) が重なって表示されます。 ファンデルワールス結合（黄色の破線）内に表示された数字は、接触点間の距離（Å）を表します。 NAE18:2 (c) または p-クマリル-HL (d) に結合した MtFAAH1 の膜アクセス チャネル (MAC) の表面の拡大図。

MtFAAH1のSBPでは、NAE18:2はThr534およびMet531を介したアシル鎖の調節を必要とするようです（図4a;補足表S6、補足ビデオS1、S2）。 これらの残基は、AtFAAH について他の場所で報告されているように、「スクイーズ」および「ロック」機構に必要であることが知られているヘリックス領域 (残基 530 ～ 536) 内にあります1。 10 ns および 100 ns で、Thr534 と NAE18:2 のアシル鎖のいくつかの炭素、つまりそれぞれ C14 ～ C16 および C12 ～ C13 の間でファンデルワールス相互作用が観察されました。 さらに、ヘリックス領域の端に位置する残基Met531は非常に柔軟性があるようで、100nsで示されているように、C10位置でNAE18:2と同様の相互作用を形成する可能性があります（図4a）。 SBPでの詳細な検査により、NAE18:2のアシルテールの立体構造が時間の経過とともに変化することが明らかになった。 実際、NAE18:2テールは、シミュレーション中、特にC12からC18まで非常に柔軟であり、100nsでC1からC9まで直線に向きました（図4a;補足ビデオS1、S2）。 したがって、長いアシル鎖を持つアシルアミドの収容に適した柔軟性の高い SBP が示唆されます。 さらに、MAC の分析により、α1 ヘリックス (残基 51 ～ 58) が内側に移動していることが明らかになりました。 この動きは、NAE18:2への結合後のMACの閉鎖につながるようであり（図4c）、これは触媒のために基質を結合ポケットに閉じ込める「ロック」機構を示唆している可能性があります（補足ビデオS3）。 対照的に、p-クマリル-HLに結合したMtFAAH1の分析は、このアリール-HLがMtFAAH1のSBPにほとんど収容されず、相互作用の可能性がほとんどないことを示唆しました（図4b;補足ビデオS4、S5）。 実際、ヘリックス領域 (残基 530 ～ 536) は p-クマリル-HL 基質とまったく相互作用していないようです。 さらに、Met531 や Thr534 などの残基は、p-クマリル-HL の芳香族尾部と相互作用するのに遠く離れており (補足ビデオ S5)、SPB のこの領域におけるタンパク質-リガンド相互作用が p-クマリルにとって非常に可能性が低いことを示唆しています。 -HL。 最後に、p-クマリル-HL構造の立体構造やMtFAAH1 MACのα1ヘリックスの動きには劇的な変化は観察されず、シミュレーション中にMACが開いた、または部分的に開いた結果となりました（図4b、図4b）。 d; 補足ビデオ S6)。

MtFAAH1の場合とは異なり、MtFAAH2aのヘリックス領域（残基532〜538）は、結合時にNAE18:2基質に向かう劇的な動きを示さなかった（図5a;補足表S6;補足ビデオS7、S8）。 それにもかかわらず、ファンデルワールス相互作用は、Tyr533とNAE18:2のアシル鎖との間のC13およびC16（10ns）およびC11およびC12位置（100ns）で見出された（図5a）。 この領域の他の残基は、NAE18:2 のアシル鎖に関与している、または密接に接触しているようには見えません。 さらに、C1 から C9 までの NAE18:2 のアシル鎖の立体構造は高度に圧縮されており、シミュレーション中にほとんど動きがないように見えました。 このリガンドは、シミュレーションの終了時に尾部の異なる炭素位置で複数の歪みを示しました（図5a;補足ビデオS7、S8）。 MtFAAH1 のよりオープンな SBP とは異なり、MtFAAH2a のより小さい SBP 内に収まる NAE18:2 は、はるかに限定的で限定的であるように見えました。 シミュレーション中に、α1 ヘリックス (残基 52 ～ 59) の非常にわずかな外側への動きが記録されました。 ただし、この動きは、MtFAAH2a MACのMACの開閉とは一致しませんでした（図5c;補足ビデオS9）。 MtFAAH2a の p-クマリル-HL への結合は、残基 Tyr533 を含む複数の相互作用によってサポートされました (図 5b; 補足ビデオ S10、S11)。 シミュレーション時間全体にわたって、このチロシン残基と p-クマリル-HL の芳香族尾部の間には一貫して密接な相互作用が存在しました。 これらのおそらくπ-π相互作用は、このリガンドを触媒作用のために所定の位置に固定している可能性があります（図5b;補足ビデオS11）。 さらに、頭部HLリングとMtFAAH2aのSBPの細胞質アクセスチャネル（CAC）に位置する残基Trp341との間の一貫した疎水性相互作用にも注目した（図5b;補足ビデオS10）。 最後に、MtFAAH2a の MAC の α1 ヘリックス (残基 52-59) で若干の外側への変位が検出されましたが (図 5b)、実質的な変化は見つからず、100 ns のシミュレーション中 MAC は閉じた立体構造を維持しました (図 5b)。 .5d;補足ビデオ S12)。

まとめると、これらのデータは、アシルエタノールアミド基質をMtFAAH1またはMtFAAH2a酵素のSBPに適合させるための明確な手段を示唆している。 私たちの MDS 実験は、これら 2 つの酵素アイソフォームによる NAE またはアリール HL 基質の優先的調節に関与する可能性のある潜在的な残基を明らかにします。

MtFAAH1 と MtFAAH2 の機能の違いをテストするために、大腸菌での組換えタンパク質の産生のため、MtFAAH (補足図 S12、補足表 S8) を His タグ融合体として発現ベクターにクローニングしました。 組換えタンパク質を精製するために、固定化金属 (ニッケル) アフィニティークロマトグラフィー (IMAC) およびサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) 技術を利用しました (図 6)。 IMAC精製およびSEC精製サンプルから、MtFAAH1およびMtFAAH2aを表す約70 kDaの顕著なバンドを観察しました（図6b、d）。 これらのバンドは、MtFAAHs タンパク質の計算された分子量 (MW) と同等でした。 各精製MtFAAHのオリゴマー化状態がAtFAAH1のオリゴマー化状態と異なるかどうかを評価するために、ゲル濾過標準およびAtFAAHのクロマトグラムからの溶出量をMtFAAH計算の参照として使用しました（図6a;補足図S13）。 MtFAAH1 および MtFAAH2a について、それぞれ 10.08 mL (pH 9.0 で) と 10.14 mL (pH 7.5 で) の平均溶出量が観察されました (補足図 S13)。 溶液中では、MtFAAH1のMWは約346 kDa、MtFAAH2aは約371 kDaと推定されました（図6c、e;補足図S13）。 MtFAAH1 および MtFAAH2 の個々のサブユニットの分子量がそれぞれ 69.6 または 70.1 kDa (図 6、補足図 S13)、報告されている DDM ミセルの MW が約 70 kDa であることを考慮すると、MtFAAH1 および MtFAAH2a がそれぞれ精製されたと推定しました。四量体として（補足図S13）。 図6b、dに使用される切り取られていない/編集されていないSDS-PAGEゲルは、補足図に示されています。 それぞれS19、およびS20ですが、補足図S13に使用された元のゲルは補足図にあります。 S21～S23。

Medicago truncatula FAAH1 および FAAH2a の精製。 (a) Superdex 200 Increase 10/300 ゲル濾過標準の GL クロマトグラム: サイログロブリン、670 kDa。 アポフェリチン、481 kDa。 γ-グロブリン、158 kDa。 オボアルブミン、44 kDa。 ミオグロビン、17 kDa。 ビタミンB12、1.35 kDa。 (b) MtFAAH1 精製中に採取された画分のクーマシー染色された SDS-PAGE ゲル。 分子量ラダー (レーン M)、超音波処理後の BL21 (DE3) 細胞の細胞溶解物 (レーン 1)、超音波処理後のペレット化した細胞破片 (レーン 2)、IMAC カラムのフロースルー (レーン 3)、IMAC 溶出 (レーン 4)、サイズ排除クロマトグラフィー精製タンパク質 (レーン 5)。 (c) Superdex 200 Increase 10/300 MtFAAH1 精製の GL クロマトグラム。 (d) MtFAAH2a 精製中に採取された画分のクマシー染色 SDS-PAGE ゲル。 分子量ラダー (レーン M)、超音波処理後の BL21 (DE3) 細胞の細胞溶解物 (レーン 1)、超音波処理後のペレット化した細胞破片 (レーン 2)、ニッケル アフィニティー カラムのフロースルー (レーン 3)、ニッケル アフィニティー精製タンパク質 (レーン4)、サイズ排除クロマトグラフィー精製タンパク質(レーン5)。 (e) Superdex 200 Increase 10/300 MtFAAH2a 精製の GL クロマトグラム。 矢印と括弧は、SDS-PAGE によって分析され、酵素活性アッセイに使用された SEC 精製画分を指します。 (b) および (d) に表示されているトリミングされていない/編集されていない SDS-PAGE ゲルは、補足図に示されています。 それぞれS19、S20。

さらに、タンデム質量分析計付き液体クロマトグラフィー（LC/MS/MS）を利用して、精製されたMtFAAHおよびAtFAAH組換えタンパク質の同一性を確認しました（補足図S14、S15、S16）。 MtFAAH1、MtFAAH2a、および AtFAAH のカバレッジ値は、それぞれ 77% (43 個の固有ペプチド)、37% (17 個の固有ペプチド)、および 100% (243 個の固有ペプチド) でした。 総合すると、これらの結果は、MtFAAH1 および MtFAAH2a タンパク質の生成と精製を示しており、精製された両方の MtFAAH タンパク質複合体が AtFAAH 二量体 1 よりも大きく、ホモテ四量体として組織化されている可能性が高いことを示唆しています。 補足図に使用されるトリミング/未編集のゲル。 S14〜S16は補足図にあります。 S24～S26。

最初の特徴付けステップとして、NAE12:0に対するMtFAAH1またはMtFAAH2aの酵素活性が、異なるpHまたは温度条件で測定されました（補足図S17）。 SEC 精製タンパク質を、さまざまな pH (6.0、7.0、8.0、および 9.0) または温度 (20、30、40、および 50 °C) 条件の反応バッファー中で 100 μM NAE12:0 とともにインキュベートしました。 他の場所で報告されているように、反応生成物の検出には柔軟なフルオレスカミンベースのアッセイが利用されました 22,36。 酵素活性は、エタノールアミンの標準曲線に基づいて、タンパク質1ミリグラム当たり1分間に生成されるエタノールアミンのμmolとして計算した。 MtFAAH1活性はpH 8.0または9.0で最高でしたが（補足図S17）、MtFAAH2aはpH 7.0または8.0で最大に機能しました（補足図S17）。 特に、MtFAAH2a の活性は pH 9.0 で劇的に減少しました。 温度依存性はMtFAAH1とMtFAAH2aの両方で同様であり、最適な酵素活性は30〜40°Cの温度でありました（補足図S17）。 GC-MS では、MtFAAH 酵素とポジティブコントロール AtFAAH の両方について、NAE12:0 の対応する遊離脂肪酸 (FFA) (補足図 S18) 生成物への変換がさらに確認されました。 煮沸した（「変性」）酵素を陰性対照として使用したが、基質から生成物への変換は示されなかった。 NAE12:0 ピークの同一性は、他の場所で報告されているように、保持時間と診断イオンによって確認されました (補足図 S18)。 FFA 12:0 (ドデカン酸) の同一性は、診断イオン (補足図 S18) および NIST ライブラリの比較 (約 98% 一致) によって確認されました。 煮沸したMtFAAH1、MtFAAH2a、またはAtFAAHとの反応では、NAE12:0基質に対応するピークのみがクロマトグラムに現れました（補足図S18）。

MtFAAH1 または MtFAAH2a 精製の進行を評価するために、NAE12:0 (100 μM) に対する細胞溶解物、IMAC、および SEC 精製画分の酵素活性を測定しました (補足表 S7)。 精製レベルと収率は、粗溶解物と比較して計算されました。 MtFAAH1 および MtFAAH2a は、細胞抽出物よりもそれぞれ 1162 倍および 3263 倍濃縮されていると推定されました。 SDSゲル電気泳動により、SEC画分の各タンパク質の純度が確認されました（図6、補足図S13）。

MtFAAH1 と MtFAAH2a の SBP 間の重要な残基の違い、およびドッキング実験が N-アシル基質の異なる調節を示唆しているという事実を考慮して、我々は、そのような違いが MtFAAH1 と MtFAAH2a の異なる基質優先性をもたらす可能性があると仮説を立てました。 NAE12:0、NAE18:2、NAE-9-HOD、OdDHL、OtDHL、p-クマリル-HL、p-クマリルチラミン、およびアフィニンの濃度を増加させて、精製MtFAAH1またはMtFAAH2aと30℃で30分間インキュベートしました（図1）。 7）。 反応生成物の検出には、フルオレスカミンベースのアッセイが使用されました。 反応の初速度 (V) は、タンパク質 1 ミリグラムあたり、1 分あたりに生成されるアミンのμmol として表示されます。 ミカエリスプロットとメンテンプロットから得られたKcat/Km比を使用して、基質に対する酵素の触媒効率を比較しました（図7）。 MtFAAH1 は、長鎖 NAE (NAE-9-HOD または NAE18:2) または AHL (OdDHL または OtDHL) に対して最も高い Kcat/Km 比を示しました。 次に、OtDHL と比較して、NAE12:0 またはアフィニンでは、Kcat/Km 比が約 2 ～ 3 倍減少しました。 p-クマリル-HLまたはp-クマリルチラミンのKcat / Km値は、MtFAAH1についてテストしたすべての基質の中で最も低かった（NAE-9-HODと比較して約7〜12倍低い）（図7a、c）。 対照的に、MtFAAH2a は、アフィニン、p-クマリルチラミン、または p-クマリル-HL に対して最も高い Kcat/Km 値を示しました。 p-クマリル-HLと比較して、NAE12:0、OdDHL、またはOtDHLでは、MtFAAH2aのKcat/Kmは約2倍減少しました。 注目すべきことに、MtFAAH2aは、NAE18:2またはNAE-9-HODに対して最も低いKcat/Km比を示しました（アフィニンの比よりも約4〜9倍低い）（図7b、d）。 これらのデータは、これらのインビトロ条件下では、MtFAAH1 は長いアシル部分を持つ親油性基質を好むのに対し、MtFAAH2a は短いアシル部分または芳香族アシル部分を持つ基質で最もよく機能することを示しています（図 8 に要約）。

(a) MtFAAH1 および (b) MtFAAH2a の酵素動態曲線。 MtFAAH を、NAE12:0、NAE18:2、NAE-9-HOD、OtDHL、OdDHL、p-クマリル HL、p-クマリルチラミン、またはアフィニンの濃度を増加させながらインキュベートしました。 反応は、反応緩衝液（25 mM HEPES、100 mM NaCl）中、MtFAAH1についてはpH = 9および0.03% DDMで、MtFAAH2aについてはpH = 7.5および0.06% DDMで実施しました。 X 軸には、さまざまな基質 (S) 濃度 (5 ～ 100 μM) が表示されます。 Y 軸では、反応速度 (V) が、使用したタンパク質の量 (mg) あたりの単位時間 (分) あたりに生成されたアミドのμmol として報告されます。 Km (Michaelis および Menten 定数) および V は、GraphPad Prism 8.0 で計算されました。 Kcat (ターンオーバー数)/Km 比は、所定の基質に対する (c) MtFAAH1 または (d) MtFAAH2a の見かけのアミドヒドロラーゼ効率を示します。 データは、3 回のアッセイの平均 ± SD を表します。

選択された N-アシルアミドに対する MtFAAH1 または MtFAAH2a の見かけのアミドヒドロラーゼ効率を示す単純化したモデル。 このモデルは、これら 2 つの MtFAAH の基質結合ポケット (SBP) の間、特にサイトゾル アクセス チャネル (CAC) とアシル結合チャネル (ABC) における構造的および物理化学的な違いが、特定の基質に対する FAAH の選択性に関連していることを提案しています。 実際、計算および生化学データは、MtFAAH1 が長い N-アシルアミドの加水分解を好むのに対し、MtFAAH2a は短いアシル鎖または芳香族尾部を持つ基質の加水分解に優れているというシナリオを示唆しています。

FAAH は NAE または NAE 様構造を加水分解して、対応するアミン (頭部基) と遊離脂肪酸 (尾部基) 生成物を生成します 1,30,37。 最近、複数の被子植物からの FAAH の構造的および系統学的比較により、FAAH の 2 つのグループ、FAAH1 および FAAH2 が発見され、これまで考えられていたものよりも複雑な FAAH-アシルアミド基質プロファイルが示唆されました 32。 ここでは、マメ科植物 Medicago truncatula の 2 つの FAAH アイソフォームが初めて構造 (予測) および機能レベルで比較され、驚くべき発見が明らかになりました。 どちらのアイソフォームもさまざまなアシルアミド基質を加水分解しますが、それらは逆の効率で加水分解します。このことは、被子植物における FAAH の合成の進化的帰結の 1 つは、これらの酵素が利用できるアシルアミド基質の範囲を拡大することであることを示唆しています。 これらの違いは、現在、アブラナ科の外に分布する FAAH アイソフォームを調べることによって初めて明らかになりつつあります 32。アブラナ科には 1 つの FAAH (FAAH1) のみが存在し、ほとんどの分子および生化学的研究が行われています。

これらの FAAH の in vitro での動態比較では、MtFAAH1 は短鎖または芳香族基質よりも長鎖 NAE (例、NAE18:2) をよりよく利用するようでした。 対照的に、MtFAAH2a は長鎖 NAE の加水分解効率がはるかに低く、代わりに短鎖または芳香族基質 (p-クマリル-HL など) を約 10 倍の効率で加水分解しました。 これら 2 つの FAAH の SBP 内の基質を使用したドッキングおよび分子動力学シミュレーション (MDS) 実験により、酵素の挙動におけるこれらの違いが裏付けられました。 MtFAAH1 は、よりオープンで制限の少ない SBP と、長鎖 NAE (例、NAE18:2) をよりよく収容する、より柔軟な膜アクセス チャネル (MAC) を有すると予測されました。 対照的に、NAE18:2が結合したMtFAAH2aのSBPは異なる形状をしており、より長いアシル鎖のより圧縮された配向と未変化の閉じたMACをもたらした。 同様に、組換え AtFAAH (FAAH1) は、極性頭部基ではなくアシル鎖の長さに依存する方法で、さまざまな NAE および AHL を加水分解しました 22。 実際、他の文献では、AtFAAH 活性は長鎖 AHL (例: OdDHL または OtDHL) で最も高く、短鎖 AHL (例: OHHL または OOHL) で最も低かったことが示されています 22。 同様に、本発明者らは、MtFAAH1が短鎖または芳香族アシル基質(例えば、p-クマリル-HL)よりもOdDHLまたはOtDHLの加水分解において著しく優れていることを観察した。 一方、短鎖または芳香族アシルアミドは、MtFAAH2a の SBP によく収容されました。 アリール-HLを用いたドッキングおよびMDS実験では、p-クマリル-HLのラクトン環頭部と芳香族尾部の両方が、MtFAAH1よりもMtFAAH2aのSBPによく収容されているように見えましたが、これはおそらく大きな芳香族化合物の存在に部分的に起因していると思われます。 MtFAAH2a の残基 (例: Tyr533、Tyr444、Trp341)。 アルカミド (アフィニンなど) は AtFAAH20 の基質としては不十分です。 ここで、MtFAAH1 の動態データは、MtFAAH1 がアフィニンよりも効率的に長鎖 NAE を加水分解するという同様の結論を裏付けています。 対照的に、MtFAAH2a は NAE と比較した場合、アフィニンに対して最も高い触媒効率を示し、MtFAAH2a の細胞質内アクセス チャネル内のより多くの非極性残基がアルカミドとの相互作用をサポートするのに役立った可能性があります。 まとめると、MtFAAH1 と MtFAAH2a の SBP 間の構造の違いとそれらの基質との予測相互作用は、観察された加水分解効率の違いと全体的に一致しているようです (図 6)。 注目すべきことに、クオラム センシング分子 p-クマリル-HL38 は、MtFAAH2a の効率的な基質でした。 M. truncatula は、微生物相互作用のための植物の化学「伝達」範囲を拡大する FAAH2 機構を進化させたと推測したくなります。 MtFAAH2a による p-クマリル-HL 加水分解の生物学的意義はこの研究の範囲を超えていますが、我々の結果は植物における MtFAAH2a の潜在的な機能をテストするための興味深いアイデアを提供します。

2 つの Medicago FAAH アイソフォーム間で観察された基質選好の相違は、2 つの分岐した FAAH アイソフォームが存在する有胎盤哺乳類の概念をいくらか思い出させます。 ヒトでは、2 つの異なる FAAH の加水分解速度 (ほぼ 20% の同一性) は、異なる基質に対していくつかの明確で重複する優先性を示しました 39。 その研究では、FAAH1 は多価不飽和基質 (NAE20:4 など) の加水分解においてはるかに効率的でしたが、FAAH2 は一価不飽和アシルアミド (オレアミドなど) を好みました。 同じ報告書で次のように述べています。 FAAH1 はアミノ酸結合アシルアミドである N-オレオイル-タウリン (NAT) を処理できましたが、FAAH2 はこの基質を利用できませんでした。 興味深いことに、両方の FAAH が同様に NAE18:139 を加水分解しました。 少なくとも哺乳動物の FAAH1 では、活性部位での基質結合が「動的パドル」を形成する 2 つの芳香族アミノ酸残基の影響を受け、これが基質選択性に寄与している可能性があることが報告されています 1,6。 哺乳動物の 3 番目のタイプのアミドヒドロラーゼは、非常に厳密な基質優先性を持っています。 ウサギ (Oryctolagus cuniculus) では、N-アシルエタノールアミノ酸アミダーゼ (NAAA) と呼ばれるシステイン加水分解酵素が NAE16:0 に対して顕著な優先性を示すことが示されており、これはその SBP の性質に依存しているようです。 実際、NAAAは進化を通じて、NAE16:0に最適で、より長いまたはより短いアシル鎖の他のアシルアミドに対しては効率が低い、制限された形状のSBPを獲得したようです40。 したがって、哺乳類と同様に、マメ科植物の M. truncatula は、さまざまなアシルアミド基質を選択的に処理する FAAH アイソフォームを精巧に作成している可能性があります。

現在グループ 1 の FAAH と考えられているものの生化学的特性は、シロイヌナズナ 1,41、イネ 42、Medicago truncatula 42、およびコケ (P. patens)9 から以前に特徴付けられていますが、すべての研究が精製酵素を使用して行われたわけではなく、すべての FAAH が行われたわけではありません 1。ホモログは、広範囲のアシルアミド基質を用いてテストされました。 ここでは、グループ 2 FAAH 酵素の生化学的特性が初めて説明され、精製の進行および酵素活性のアッセイにおいて、グループ 1 FAAH アイソフォームとのいくつかの類似点および相違点が認められました。 上述のような見かけの基質選好性の違いに加えて、酵素の他の特徴も異なっていました。 MtFAAH2a の等電点は、MtFAAH1 (または他の FAAH1 タンパク質) の等電点よりも大幅に高く、精製の過程で溶解度の条件を変更する必要がありました (また、in vitro アッセイの最適 pH にも影響を与えたと考えられます)。 他で報告されているように、タンパク質の等電点に関連して緩衝液の pH を考慮することは、組換えタンパク質の精製にとって重要です 43。 さらに、MtFAAH2 は、精製の進行中に可溶化を維持するために、MtFAAH1 と比較して 2 倍の濃度の DDM を必要としました。 これらの違いにもかかわらず、MtFAAH1 と MtFAAH2a は両方ともほぼ均一になるまで精製され、既知の標準と比較した移動量に基づくと、両方とも SEC においてホモマー四量体として分離されるようでした。 全体として、ここで特定された要因は、他の植物種における FAAH 酵素の将来の研究を促進するでしょう。

我々のデータは、MtFAAH1 と MtFAAH2a はどちらも、界面活性剤を含む溶液中で精製すると四量体オリゴマーとして見出され得るのに対し、AtFAAH は二量体として可溶化されるという概念を一貫して支持しました。 以前の報告では、複数の生物の FAAH のオリゴマー状態が支持されています。 例えば、シロイヌナズナまたは真菌カンジダ・アルビカンス由来の FAAH の結晶構造は二量体を示しています 1,44。 特に、ラット FAAH は、溶液中で精製すると二量体としても報告されていますが、界面活性剤の非存在下では 3 つの八量体の二量体を形成する可能性があります 45。 ここで Medicago truncatula から精製されたアポ酵素の明らかなサイズの違い（構造が存在する唯一の他の植物 FAAH、AtFAAH とは異なる）は興味深いものであり、重要な機能的意味を持っている可能性がありますが、四次構造とその機能的関連性は将来を待たなければなりません。勉強します。 さらに、この予測された四量体組織がアブラナ科以外の他の植物種に由来する FAAH アイソフォームの特徴であるかどうかはまだわかっていません。

結論として、MtFAAH は、広範囲の NAE、アシル-HL、アリール-HL、アルカミド、またはフェノールアミドを異なって加水分解します。 このような結果は、MtFAAH1 と MtFAAH2a の SBP の予測された構造組織間の差異と一致します。 私たちの調査では、植物組織（NAEなど）または細菌（AHLなど）に内因的に蓄積すると報告されている基質に対するMtFAAHのin vitro能力をスクリーニングしましたが、生理学的関連性を持つ追加の親油性基質がまだ発見されていない可能性があります。 。 遺伝的および生理学的レベルでのさらなる研究は、Medicago truncatula における追加の FAAH アイソフォームの機能を解明するのに役立ちます。 さらに、植物における FAAH 媒介アシルアミド加水分解のより広範な重要性を判断するには、他の植物種における FAAH アイソフォームの追加の検査が必要となるでしょう。 それにもかかわらず、この研究は、潜在的な生理学的重要性とバイオテクノロジーへの応用の可能性を明らかにするための将来の研究の基礎を提供します。

図1aに使用したマメ科植物の配列は、NCBIデータベースから取得したものです（補足表S1）。 系統解析は、デフォルト設定の「Phylogeny.fr」オンラインツールを使用して実行されました46。 配列アラインメントは、Clustal Omega47 で実施されました (補足図 S1、S7)。 MtFAAH1 および MtFAAH2a 相同性モデルは、SWISS-MODEL48 で鋳型としてシロイヌナズナ FAAH (AtFAAH; 6DHV) を使用して構築されました。 3D モデルは、Pymol49 および BIOVIA Discovery Studio Visualizer50 で視覚化されました。 MtFAAH の膜結合キャップ (MBC)、膜アクセス チャネル (MAC)、ヘリックス領域 (アシルアミド尾部の調節に関与すると予測される)、および基質結合ポケット (SBP) 構造を構成する残基は、AtFAAH 構造の詳細から予測されました 1 (図4、5;補足表S5、S6）。 Antheprot3D は二次構造内容の予測に使用されました 51 (補足図 S5)。 SWISS-MODEL で生成された MtFAAH モデルの品質パラメーターには次のものがあります。 GMQE（グローバルモデル品質推定）、QMEANDisCo（Qmeanコンセンサスベースの距離制約）スコア、およびラマチャンドランプロットとスコア（補足図S3、S4;補足表S3、S4）。

MtFAAH1、MtFAAH2a、および MtFAAH2b の発現プロファイルは、Medicago truncatula Gene Expression Atlas「MtExpress」34 から取得されました。 対応する MtFAAH 配列 (アクセッション番号については補足表 S1 を参照) を、Atlas 内に構築された BLAST ツールの入力として使用しました。

MtFAAH1 および MtFAAH2a のアポ型のトポロジーは、Amber 力場 (ff19SB) を使用して実行されました 52。 apo MtFAAH アイソフォームの周囲に 12 Å の立方体ボックスを構築し、その系を TIP3P 水に溶媒和しました 53。 電荷の中和は、濃度 0.15 M の Na+ および Cl- イオンによって行われました。システムは、温度 298 K、圧力 1 bar でエネルギー最小化を受けました。 次に、システムを 500 kJ/mol の力定数で 5 ns の間平衡させました。 分子動力学シミュレーション (MDS) は、別の場所で開発されたクラウドベースの分子シミュレーション環境で実行されました54。 このパイプラインは、Open MM ツールキット 55 を利用して、定温定圧 (NPT) アンサンブルを生成します。 MD 環境の温度は 298 K、圧力は 1 bar でした。 Google Collab の GPU とコンピューター ユニットを使用して、両方の MtFAAH に対して 100 ns のシミュレーションを実行しました。 各シミュレーションが完了するまでに 12 ～ 13 時間かかりました。 RMSD および RMSF 軌跡は、MDAnalysis56 または PyTraj57 ツールキットを使用して生成され、Excel 2021 でさらに処理されました (補足図 S8)。

すべての 2D 構造は ChemDraw (Molecular Editor) ソフトウェアを使用して描画されました。 基質と酵素は次のように調製しました。 NAE18:2 (CID: 5,283,446)、NAE12:0 (CID: 8899)、または p-クマリル-HL (CID: 71,311,837) の SDF ファイルが PubChem から取得されました。 次に、Babel 3.0.158 を使用して SDF ファイルを PDB 形式に変換しました。 100 ns の MDS 後に生成されたアポ MtFAAH 構造の PDB ファイル (上記参照) を、水、Na + および Cl- イオンの除去前のドッキング実験に使用しました。 Pymol49 の基質および MtFAAH1 または MtFAAH2a タンパク質モデルに水素を添加しました。 エネルギーの最小化は、デフォルト設定の PyRx59 で実行されました。

GOLD 3.0.1 ソフトウェア 60 でのドッキングは、MtFAAH1 (Ser304、原子番号 4628) または MtFAAH2a (Ser311、原子番号 4678) の触媒残基の側鎖酸素 (Oγ) とカルボニルの炭素の間の共有結合を中心としていました。 NAE18:2、NAE12:0、または p-クマリル-HL のいずれか。 空洞検出は、活性部位の周囲の半径 20 Å で設定されました。 拘束設定では、50 ～ 500 のばね定数、最小間隔 (1.30 Å) と最大間隔 (1.60 Å) が使用されました。 ファンデルワールスおよび水素結合のアニーリングパラメータは、それぞれ6および3Åに設定されました。 アルゴリズムは、外部エネルギー値と内部エネルギー値がそれぞれ 1.4 と 1.0 に設定されました。 予測されたポーズは、フィットネス GOLD スコアに基づいてランク付けされました。 最高スコアのポーズがさらなる分析のために選択されました。 この研究で選択されたすべてのポーズの GOLD スコアは 10 以上でした。ドッキング予測は Pymol49 および BIOVIA Discovery Studio Visualizer50 で視覚化されました。 水素結合や疎水性相互作用などの推定上の相互作用は、タンパク質-リガンド相互作用プロファイラー (PLIP) サーバーで予測されました61。

タンパク質 (MtFAAH1 または MtFAAH2a) とリガンド (NAE18:2 または p-クマリル-HL) のトポロジーは、それぞれアンバー力場 ff19SB55 および GAFF262 を使用して生成されました。 タンパク質-リガンド複合体の周囲に 15 Å の立方体ボックスを構築し、次に系を TIP3P 水中で溶媒和しました 53。 電荷の中和は、濃度 0.15 M の Na+ および Cl- イオンによって行われました。システムは、温度 298 K、圧力 1 bar でエネルギー最小化を受けました。 システムは、5 ns の間、1600 kJ/mol の力定数で平衡化されました。 MDS 実験は、別の場所で開発されたクラウドベースの分子シミュレーション パイプラインで実行されました54。 平衡化に使用したのと同じ温度と圧力を MD の製造にも使用しました。 Google Collab の GPU とコンピューター ユニットを使用して、すべての MtFAAH リガンド複合体について 100 ns のシミュレーションを実行しました。 各シミュレーションが完了するまでに 12 ～ 13 時間かかりました。 軌跡とログ ファイルは 100 ps ごとに記録されました。 さらに、MtFAAH の触媒残基の側鎖酸素 (Oγ) とリガンドのカルボニル基の炭素の間の共有結合相互作用を模倣するために、パイプラインの MonteCarloBarostat ツールの下でこれらの原子間に調和制約を追加しました。」雨を降らせてください」54. RMSD および RMSF 軌跡は、MDAnalysis56 または PyTraj57 ツールキットを使用して生成され、Excel 2021 で処理されました (補足図 S10)。 ピアソンの相互相関分析は、同じパイプライン内で生成されました 54 (補足図 S11)。 平衡化した複合体 (時間 = 0 ns)、および 10 ns および 100 ns で MD 処理した複合体を、構造から水と Na+ および Cl- イオンを除去することによって Pymol49 で処理しました (図 4 および 5)。 MtFAAH リガンド複合体の PDB ファイルと dcd 軌跡は、MD シミュレーションの分析のために VMD ソフトウェア 63 にロードされました。 VideoMach64 を VMD と組み合わせて、MDS 実験に対応するビデオ (補足ビデオ S1 ～ S12) を生成しました。

Qiagen RNeasy Plant Mini Kit を、生後 21 日の Medicago truncatula Gaertner (野生型遺伝子型 Jemalong A17) 苗の茎からの RNA 抽出に使用しました。 M. truncatula (A17) 種子は、他の場所で報告され利用されているように、ノース テキサス大学 (UNT) の Rebecca Dickstein 博士から贈られたものです 65。 RNA 抽出に使用される苗木は照明付きチャンバー内で栽培され、その使用は国際、国家、および/または機関のガイドラインに準拠していました。 cDNA合成は、Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Thermo Fisherキットを用いて、製造業者の指示に従って実施した。 MtFAAH1の全長コード配列（CDS）を得るには、2ラウンドのPCR（ネステッドPCR）が必要でした（補足図S12）。 MtFAAH1 の停止コドンは、特定のプライマーを使用して CDS から除去されました (補足表 S8)。 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England BioLabs) を高忠実度 PCR に使用しました。 1 Kb MassRuler DNA ラダー (Thermo Fisher) を使用して、PCR 産物のサイズを推定しました。 ｐＴｒｃＨＩＳ２プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＭｔＦＡＡＨ１ ＣＤＳの挿入は、製造業者の指示に従って、ＴＡクローニングによって達成された。

MtFAAH2a の CDS を GENEWIZ で合成し、pUC57-Amp ベクターに挿入しました。 次に、上記のように、特定のプライマー（補足表S8）を使用して、終止コドンを除去し、pTrcHIS2プラスミド（Invitrogen）にサブクローニングしました（補足図S12）。 異種発現の前に、DNA 配列決定によってすべてのベクターが正しいことが確認されました。

組換えMtFAAH1は、C末端c-mycおよびヒスチジン(6X)タグを有するpTrcHIS2プラスミド(Invitrogen)から大腸菌BL21(DE3)細胞内で産生された。 一晩培養物を 100 μg/mL アンピシリン (GoldBio) を使用して 37 °C で増殖させ、100 μg/mL アンピシリンを含む新鮮な LB に接種し、OD600 が 0.5 ～ 1.0 に達するまで 37 ℃ で増殖させました。 タンパク質産生は、1 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (GoldBio) を使用して 16 °C で 18 時間誘導されました。 細胞を4000×g、4℃で30分間遠心分離することによって回収し、次に-80℃で一晩凍結した。 溶解バッファー (50 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl、1% (v/v) Triton X-100)、1 mM EDTA、1 μM E-64、1 μM ペプスタチン、1 mg/mL リゾチーム (Sigma) で解凍した後）および２５単位／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）をすべて添加した。 細胞ペレットを、4℃で30分間、30 RPMで回転させて懸濁し、その後、30秒のオンパルスと30秒のオフパルスで20％の強度で8分間超音波処理しました（超音波プロセッサGEX 130）。 細胞破片を 14,000 Xg、4 °C、30 分間でペレット化し、ライセートを Ni-NTA アガロース樹脂 (Qiagen) とインキュベートし、30 RPM で 1 時間、4 °C で回転させて懸濁しました。 重力流カラムを使用して細胞溶解物を樹脂から完全に分離した後、樹脂を 2 つのバッファーで洗浄しました。(1) 50 mM Tris-HCl pH 8.0、500 mM NaCl、1% Triton X-100、10 mM イミダゾール。 (2) 50 mM トリス-HCl pH 8.0、500 mM NaCl、0.03% (w/v) ドデシル ベータ-D-マルトシド (DDM)、25 mM イミダゾール。 次に、His タグ付き組換えタンパク質を、50 mM Tris-HCl pH 8.0、500 mM NaCl、0.03% DDM、250 mM イミダゾール、1 mM EDTA、1 μM E-64、1 μM ペプスタチンを使用して樹脂から溶出しました。 DTT (1 mM) を溶出画分に新たに加え、4 °C で一晩保存しました。 翌日、溶出画分を濃縮し、30,000 MWCO 遠心フィルター装置 (Sartorius) を使用して、50 mM ビス-トリス-プロパン pH 9.0、100 mM NaCl、0.03% DDM に交換しました。 組換えタンパク質をさらに精製し、AKTA Pure システム (Cytiva) 上の Superdex 200増加 10/300 GL カラム (Cytiva) を使用して分画しました。 SEC で溶出された画分は 280 nm の UV 吸光度で観察され、SDS-PAGE 分析、LC/MS/MS、または酵素活性アッセイのために分画および収集されました。

組換えMtFAAH2aは、緩衝液pHおよび界面活性剤濃度を除いてMtFAAH1と同じ方法(上記参照)で精製した。 MtFAAH2a の場合、精製プロセス中、すべてのバッファーは pH 7.5 および 0.06% DDM でした。 SEC 画分は、SDS-PAGE 分析、LC/MS/MS、および酵素活性アッセイのために収集されました。

ゲルバンドを 100% アセトニトリルを使用して脱水し、100 mM 重炭酸アンモニウム中の 10 mM ジチオスレイトール、pH ≈ 8、56 °C で 45 分間インキュベートし、再度脱水し、暗所で 100 mM 重炭酸アンモニウム中の 50 mM ヨードアセトアミドとともに 20 分間インキュベートしました。分。 次いで、ゲルバンドを100mM重炭酸アンモニウムで洗浄し、再度脱水した。 シーケンスグレードの修飾トリプシン、キモトリプシン、および Asp-N を 50 mM 重炭酸アンモニウムで 0.01 μg/μL に調製し、これの約 50 μL を各ゲル バンドに添加して、ゲルが完全に浸るようにしました。 次にバンドを 37 °C で一晩インキュベートしました。 60% アセトニトリル/1% TCA 溶液中で水浴超音波処理によりゲルからペプチドを抽出し、約 2 μL になるまで真空乾燥しました。

次にペプチドを 2% アセトニトリル/0.1% TFA に再懸濁して 20 μL にしました。 これから、EASYnLC 1000 によって 5 μL が Thermo Acclaim PepMap 0.1 mm × 20 mm C18 ペプチド トラップに自動的に注入され、約 5 分間洗浄されました。 次に、結合ペプチドを Thermo Acclaim PepMap RSLC 0.075 mm × 250 mm C18 カラム上で 24 分で 5% B から 38% B の勾配で 35 分間かけて溶出し、25 分で 90% B まで上昇させ、90% B に保持しました。 0.3 µL/min の一定流量で分析を継続します (バッファー A = 99.9% 水/0.1% ギ酸、バッファー B = 99.9% アセトニトリル/0.1% ギ酸)。 一体型カラムヒーター (PRSO-V1、Sonation GmbH、ビーベラッハ、ドイツ) を使用してカラムを 50 °C に維持しました。

溶出されたペプチドは、Flex Spray スプレー イオン源を使用して ThermoFisher Q-Exactive 質量分析計にスプレーされました。 サーベイ スキャンは Orbitrap (解像度 70,000、m/z 200 で測定) で取得され、各サーベイ スキャンの上位 15 イオンが自動高エネルギー衝突誘起解離 (HCD) にかけられ、フラグメント スペクトルが 17,500 解像度で取得されました。 得られた MS/MS スペクトルは、Mascot Distiller v2.8.0.1 (www.matrixscience.com) を使用してピーク リストに変換し、Uniprot (www.matrixscience.com) から入手可能な FAAH タンパク質配列および E.coli タンパク質配列を含むデータベースに対して検索しました。 uniprot.org)、Mascot 検索アルゴリズム v 2.7.1 を使用して、一般的な実験室汚染物質 (cRAP プロジェクトの www.thegpm.org からダウンロード) が追加されました。 次に、Mascot の出力を Scaffold v5.0.1 (www.proteomesoftware.com) を使用して分析し、タンパク質の同定を確率的に検証しました。 Scaffold 1% FDR 信頼度フィルターを使用して検証された割り当ては、真とみなされます。 質量分析プロテオミクス データは、データセット識別子 PXD038494 および https://doi.org/10.6019/PXD038494 とともに、PRIDE67,68 パートナー リポジトリを介して ProteomeXchange Consortium66 に寄託されています。

標準曲線は、Cytiva SEC ハンドブックに従って、既知の標準物質 (チログロブリン、γ-グロブリン、オボアルブミン、ミオグロビン、およびビタミン B12、Bio-Rad、アポフェリチン、Sigma) の分子量の対数に対する分配係数 (Kav) をプロットすることによって作成されました。 、付録 6. MtFAAH の精製に使用した異なる条件に関連して、2 つの別個の標準および標準曲線を作成しました。次に、異なる日に実行された 6 回の精製からのピークの平均溶出量を使用して、各 FAAH の Kav を計算しました。 この値をそれぞれの曲線に補間した後、分子量を計算し、界面活性剤の凝集数を考慮してオリゴマー化状態を推定しました 35。 計算はGraphPad Prism 8.0で行われました。

精製の進行中に採取されたサンプルは、BCA Rapid Gold アッセイ (Thermo) によって定量され、準備された 10% 分解能ゲルで SDS-PAGE (Bio-Rad) によって分離されました。 10 マイクログラムの細胞溶解物、ペレット化した細胞破片、およびフロースルーを、2 μg のニッケルアフィニティー精製タンパク質および 2 μg の SEC 精製タンパク質とともに SDS-PAGE に供しました。 サンプルを 10% (v/v) β-メルカプトエタノールを含む 4 × Laemmili バッファー (Bio-Rad) で変性し、電気泳動を 175 定ボルトで 50 分間実施しました。 次に、メーカーのプロトコルに従って、ゲルをQCコロイドクーマシーブルー染色（Bio-Rad）で染色しました（図6b、d;補足図S14〜S16、S19、S20、S24〜26）。 あるいは、実験ではBIO-RADの無染色ゲルが使用されました（補足図S13、S21〜S23）。 アミノ酸配列の分子量 (MW) と等電点 (pI) は、オンラインの ExPasy ツール (https://web.expasy.org/protparam) を使用して計算されました。 終止コドンがなければ、MtFAAH1 の分子量は 66.02 kDa、pI は 5.83 でしたが、MtFAAH2a の分子量は 66.71 kDa、pI は 8.48 でした。 ゲルバンドを分析し、FAAH の計算された分子量を参照して既知の標準 (Precision Plus Protein Standards、Bio-Rad) と比較しました。 図6b、dに使用される切り取られていない/編集されていないSDS-PAGEゲルは、補足図に示されています。 それぞれS19、S20。 補足図S13に使用される切り取られていない/編集されていないSDS-PAGEゲルは、補足図S13に見られます。 S21〜S23に対して、補足図に使用された元のゲル。 S14〜S16は補足図にあります。 S24～S26。

GCMS ベースの酵素活性アッセイは、基質と反応生成物を確認するために、他の場所で説明されているように 12 、いくつかの変更を加えて実施されました。 簡単に説明すると、反応バッファー 1 (50 mM Bis-Tris Propane; pH = 9.0; 0.03% DDM) または反応バッファー 2 (50 mM Tris-HCl、500 mM NaCl; pH = 7.5; 0.06% DDM) を 100 μM ( NAE12の最終濃度（DMSO中の10mM原液から希釈）：0。 次に、5μgの組換えMtFAAH1またはMtFAAH2aをそれぞれ反応混合物1または2に添加した。 反応混合物１中の１μｇのＡｔＦＡＡＨとの反応は、陽性対照として含まれた。 反応混合物を振盪(120 RPM)しながら30℃で1時間インキュベートした。 煮沸した酵素を用いた並行反応 (80 ～ 100 °C で 15 ～ 30 分) を陰性対照として含めました。 予熱したイソプロパノール (IPA) を加えて反応を停止し、70 °C で 30 分間インキュベートしました。 次に、クロロホルムベースの抽出法を実行して、反応によって生成された脂質を単離しました。 脂質生成物を N2 下で乾燥させ、誘導体化 (50 °C で 30 分間) のために 50 μL の BSTFA に再懸濁しました。 次に、サンプルを N2 下で乾燥させ、70 μL のヘキサンに再懸濁しました。 サンプルは、以下の条件下で GCMS (モデル Agilent 7693) によって分析されました。 内圧とパージ流量がそれぞれ 48 (kPa) と 50 (mL/min) のパルススプリットレス (注入モード)。 ヘリウムは移動キャリア相でした。 固定相は、長さ３０ｍｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μＭのキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ－５ｍｓ ＧＣカラム）であった。 GCMS は電子衝撃 (EI) MS モジュール用に調整され、質量スペクトル データはフルスキャン モードで収集されました。 反応生成物はトリメチルシリル (TMS) 誘導体であることが確認されました。 最後に、反応からの脂質種の同定と定量化は、ピーク保持時間、対応する質量スペクトル、TMS イオン診断種、および/または NIST (国立標準技術研究所) ライブラリ検索の分析によって実行されました。

フルオレスカミンベースの酵素活性アッセイは、他の場所で開発および記載されているように 22,36 、いくつかの変更を加えて実施されました。 異なる pH 条件での酵素活性アッセイでは、組換え MtFAAH1 または MtFAAH2a (1 μg) を反応緩衝液 1 (100 mM K-リン酸、6 mM K2-リン酸、pH = 6) 中で 100 μM の NAE12:0 とインキュベートしました。反応バッファー 2 (25 mM HEPES、100 mM NaCl、pH = 7)、反応バッファー 3 (25 mM HEPES、100 mM NaCl、pH = 8)、または反応バッファー 4 (25 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、pH = 7) = 9) 96 ウェル多層プレートで 30 °C で 5 ～ 10 分間静置します。 DDM (0.03% または 0.06%) を、それぞれ MtFAAH1 または MtFAAH2a との各反応に添加しました。 基質をストック溶液から所望の最終濃度まで添加して、反応を開始した。 煮沸した酵素を用いた並行反応 (80 ～ 100 °C で 30 分間) を陰性対照として含めました。 実験では 3 つの独立した反応 (反復) を実行しました。 ２０μＬのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（ＤＭＳＯ中の１０ｍＭストック）を添加することによって反応を停止させた。 蛍光ベースのアッセイ用に、15 μL のアリコートを 96 ウェルマイクロプレート内で 45 μL のフルオレスカミン (アセトン中 3.6 mM ストック) およびミリリク水 97.5 μL と混合しました。 反応混合物を室温で5分間インキュベートした。 蛍光は、390 nm (励起) および 475 nm (発光) に設定した BioTek Synergy 2 マルチモード マイクロプレート リーダーで測定しました。 反応からの生の蛍光値をネガティブコントロールの読み取り値から差し引いた。 次に、蛍光値を生成されたエタノールアミンのμmol に変換するために、フルオレスカミンと反応させたエタノールアミン (Sigma-Aldrich) の濃度を変えて標準曲線を個別に構築しました。 5 つの異なる温度条件 (20、30、40、50、または 80 °C) での酵素活性アッセイも上記のように実行しました。

精製表 (補足表 S7) では、細胞溶解物、IMAC または SEC 精製画分を、上記の戦略に従って、NAE12:0 に対する酵素活性試験の酵素源として使用しました。 総活性は酵素単位 (U) として表され、これは単位時間 (分) あたりに生成される生成物 (エタノールアミン) のμmol を表します。 比活性は、総活性をアッセイで利用したタンパク質の量（mg）で割ることによって計算した。 収量はパーセント値で表され、各精製ステップ後に保持される酵素活性を表します。 IMAC または SEC 画分の収量は、これらの各ステップの総活性を粗細胞溶解物に由来する総活性で割ることによって計算されました。 精製レベルは、IMACまたはSEC画分の比活性と粗細胞溶解物について計算された比活性の間の比として計算されました。 3 回の独立した反応の平均を補足表 S7 に示します。

酵素動態アッセイでは、組換え MtFAAH1 または MtFAAH2a (1 μg) を、pH = 9 および 0.03 の反応バッファー (25 mM HEPES、100 mM NaCl) 中で、濃度を増加させながら NAE または NAE 様基質 (5 ～ 100 μM) とインキュベートしました。 MtFAAH1 および pH = 7.5 では % DDM、MtFAAH2a では 0.06% DDM。 反応混合物を 30 °C で 5 ～ 10 分間インキュベートしました。 煮沸した酵素を用いた並行反応 (100 °C で 30 分間) を陰性対照として含めました。 実験では 3 つの独立した反応 (技術的反復) が実行されました。 基材が含まれています。 NAE12:0 (社内合成)、NAE18:2 (Cayman Chemical)、NAE-9-HOD (他で報告されているように社内合成 23)、OdDHL (Sigma-Aldrich)、OtDHL (Sigma-Aldrich)、p-クマリル- HL (Sigma-Aldrich)、p-クマリルチラミン (David Mackey 博士からの贈り物)、およびアフィニン (Jorge Molina Torres 博士からの贈り物)。 ２０μＬのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を添加することによって反応を停止させた。 反応物のアリコートを、上記のようにフルオレスカミンおよび水と混合した。 混合物を室温で５分間インキュベートした。 蛍光を上記のように測定した。

蛍光値を生成されたアミンのμmol に変換するために、エタノールアミン (Sigma-Aldrich) (NAE の場合)、ホモセリンラクトン (Sigma-Aldrich) (AHL および p-クマリル-HL の場合)、チラミン (Sigma) の濃度を増加させて標準曲線を作成しました。 -Aldrich) (p-クマリルチラミンの場合)、またはイソブチル アミン (アフィニンの場合) (Sigma-Aldrich) 標準。 見かけの酵素反応速度パラメータは、GraphPad Prism 8.0 で計算されました。 近似した曲線の R2 値は、MtFAAH1 では 0.54 ～ 0.94、MtFAAH2a では 0.78 ～ 0.94 でした。

現在の研究中に生成および分析された質量分析プロテオミクス データは、ProteomeXchange 経由で識別子 PXD038494 で入手できます。

この記事のオリジナルのオンライン版は改訂されました: 添付の補足ビデオ 2、補足ビデオ 3、補足ビデオ 4、補足ビデオ 5、補足ビデオ 6、補足ビデオ 7、補足ビデオ 8、補足ビデオ 9、補足ビデオ 10 の順序、補足ビデオ 11 および補足ビデオ 12 は、補足ビデオ 10、補足ビデオ 11、補足ビデオ 12、補足ビデオ 2、補足ビデオ 3、補足ビデオ 4、補足ビデオ 5、補足ビデオ 6、補足ビデオ 7、補足ビデオと誤って記載されていました。 8 および補足ビデオ 9。補足ビデオ 1 は公開時点から正しいものです。

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分子ドッキング実験に使用された GOLD 3.0.1 ソフトウェアへのアクセスを提供してくださった Xiaoqiang Wang 博士 (ノース テキサス大学 BioDiscovery Institute) に感謝します。 実験で使用した p-クマリルチラミンを提供していただいた David Mackey 博士 (オハイオ州立大学園芸作物科学部) に感謝します。 実験で使用したアフィニンを提供してくださった Jorge Molina Torres 博士 (CINVESTAV-IPN、イラプアト、メキシコ) に感謝します。 LC/MS/MS における組換えタンパク質の同定にご協力いただいた Douglas Whitten (ミシガン州立大学研究技術支援施設) に感謝します。 この研究は、米国国立科学財団 (IOS 2051636) の支援を受けました。

米国テキサス州デントン、ノース テキサス大学生物科学部 BioDiscovery Institute

オマール・アリアス＝ガガンセラ、エミリー・ヘレル、ミナ・アジズ、ケント・D・チャップマン

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OAG、EH、MA、KDC が計画した研究。 MA はタンパク質精製の初期条件を確立し、酵素活性アッセイに関するアドバイスを提供しました。 OAG と EH が実験を実施しました。 OAG、EH、KDC がデータを分析しました。 OAG と EH は原稿の初稿を書きました。 KDC が原稿を編集しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ケント・D・チャップマンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Arias-Gaguancela, O.、Herrell, E.、Aziz, M. 他微生物由来および植物由来のアシルアミドに対して異なる優先性を持つ 2 つのマメ科植物の脂肪酸アミド加水分解酵素アイソフォーム。 Sci Rep 13、7486 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34754-z

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受理日: 2023 年 5 月 6 日

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